1.一种白蚁胚胎发育的研究方法,其特征是:包括不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究,包括以下步骤:(1)收集白蚁卵
将工蚁、兵蚁、无翅繁殖蚁以10:1:1的比例养虫室避光饲养,获得无翅繁殖蚁产出的白蚁卵;
(2)白蚁卵前期处理
将白蚁卵清除白蚁卵表面的杂质和病原菌后进行离巢饲养,所述离巢饲养的具体方法为:在超净工作台中将清洗完毕的白蚁卵用灭过菌的刷子,扫至1.5%琼脂糖平板配有
200PPM四环素和200PPM多菌灵的培养基上,用封口膜封口,放入恒温箱避光放置,获得不同发育天数的白蚁卵,以用于不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究和白蚁卵人工孵化研究;
(3)不同发育阶段的白蚁卵胚胎染色研究
a.卵壳的软化
将发育天数为1-30天白蚁卵先放到-80摄氏度冰箱冷冻处理10min,分别进行软化处理,处理时间和方法如下:发育天数为1-7d的白蚁卵,加入30%次氯酸钠溶液处理8min,静止;
发育天数为8-15d的白蚁卵,加入50%次氯酸钠溶液处理10min,静止;
发育天数为16-22d的白蚁卵,加入70%次氯酸钠溶液处理8min,静止;
发育天数为23-30d的白蚁卵,加入80%次氯酸钠溶液处理10min,静止;
所述次氯酸钠溶液加样量为每25-35个白蚁卵样品,加入2ml上述次氯酸钠溶液;上述处理后均将次氯酸钠溶液用移液枪吸出,将软化处理后的白蚁卵用1×PBS润洗3次,所述PBS为磷酸缓冲液Phosphate Buffered Saline,pH为7.4;
b.卵的固定
上述软化处理后的白蚁卵,分别进行固定,所述白蚁卵固定方法如下:上述不同发育天数的白蚁卵均加入10%多聚甲醛(Paraformaldehyde)溶液,每25-35个白蚁卵加入2ml的10%多聚甲醛溶液,室温下200 rpm摇1h固定,后用移液枪吸出多聚甲醛溶液;
c.白蚁卵的染色
上述不同发育天数的白蚁卵固化处理后,随即加入预先配好的染色液(DAPI:PBS =1:
1000),每25-35个白蚁卵加入1ml染色液,用锡纸包好避光保存,置于室温中染色16h,后将DAPI溶液用移液枪吸出,后加入1mlPBS(1×)清洗,每次静置10min,重复三次;
d.制片与保存
用移液枪将上述处理的白蚁卵与剩余溶液全部吸走至载玻片上,吸除PBS缓冲液后加入100μL 50%甘油(甘油:PBS=1:1)溶液,盖上盖玻片,观察胚胎发育情况;
(4)白蚁卵人工孵化研究
将采集发育天数为27-29天的白蚁卵,放入设有无菌的湿润原浆纸的培养皿中,配有润湿的松木条,并放入同一种群工蚁,白蚁卵和工蚁的数量比为25:10,进行人工孵化。