1.一种靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物
将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养,筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物;
所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX‑Gla‑PC融合基因和报告基因的质粒,所述FIX‑Gla‑PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
2)筛选特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物
对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定,筛选出特异性抑制VKOR蛋白活性的小分子化合物;
步骤2)中,VKOR蛋白活性抑制测定的方法如下:
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中,用荧光检测仪检测荧光,设定激发光的波长为245‑
255nm、发射光的波长为420‑440nm,用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性;
和/或者,
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中,用荧光检测仪检测荧光,设定激发光的波长为245‑255nm、发射光的波长为420‑440nm,用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性;
所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为:分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3,配制得到GSH浓度为60‑160mmol/L、维生素K环氧化物浓度为30‑80μmol/L的维生素K环氧化物工作液;
所述维生素K工作液的配制方法为:分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液4,配制得到GSH浓度为60‑160mmol/L、维生素K浓度为30‑80μmol/L的维生素K工作液;
所述VKOR蛋白工作液的配制方法为:分别取VKOR蛋白和缓冲液1,配制得到VKOR蛋白浓度为1‑5μmol/L的VKOR蛋白工作液;
缓冲液1的组成包括:pH值7.0‑8.0的Tris‑HCl 20‑50mmol/L,NaCl 100‑150mmol/L,LMNG或GDN 0.5‑5g/L,溶剂为水;
缓冲液2的组成包括:GSH 0.4‑1mol/L,溶剂为水;pH值7.0‑7.6;
缓冲液3的组成包括:维生素K环氧化物1‑50mmol/L,溶剂为异丙醇;
缓冲液4的组成包括:维生素K1‑100mmol/L,溶剂为异丙醇。
2.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex。
3.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述报告基因为甲虫荧光素酶报告基因,甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述同时表达FIX‑Gla‑PC融合基因和报告基因的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1~20μmol/L。
6.据权利要求1所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:所述终点法计算荧光值的增加量为:用荧光检测仪每隔一段时间检测一次荧光,检测总时长为1‑2小时;VKOR蛋白的活性=反应1小时的荧光值FT1‑反应开始时的本底荧光值FT0。
7.一种如权利要求1‑6中任一项所述的靶向抑制维生素K环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法筛选出的小分子化合物。
8.一种如权利要求7所述的小分子化合物作为制备靶向维生素K环氧化物还原酶的抑制剂的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:小分子化合物的结构式如下: