1.一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物
将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养,筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物;
所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒,所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
2)筛选对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物
对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定,筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物;
3)筛选靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物
用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定,得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物。
2.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞
293Trex。
3.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述报告基因为甲虫荧光素酶报告基因,甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤1)中,所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1~
20μmol/L。
6.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:步骤2)中,VKOR蛋白活性抑制测定的方法如下:将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中,用荧光检测仪检测荧光,设定激发光的波长为245-
255nm、发射光的波长为420-440nm,用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性;
和/或者,
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中,用荧光检测仪检测荧光,设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm,用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性。
7.根据权利要求6所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为:分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3,配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K环氧化物浓度为30-80μmol/L的维生素K环氧化物工作液;
所述维生素K工作液的配制方法为:分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液4,配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K浓度为30-80μmol/L的维生素K工作液;
所述VKOR蛋白工作液的配制方法为:分别取VKOR蛋白和缓冲液1,配制得到VKOR蛋白浓度为1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液;
缓冲液1的组成包括:pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L,NaCl 100-150mmol/L,LMNG或GDN 0.5-5g/L,溶剂为水;
缓冲液2的组成包括:GSH 0.4-1mol/L,溶剂为水;pH值7.0-7.6;
缓冲液3的组成包括:维生素K环氧化物1-50mmol/L,溶剂为异丙醇;
缓冲液4的组成包括:维生素K1-100mmol/L,溶剂为异丙醇。
8.根据权利要求6或7所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法,其特征在于:所述终点法计算荧光值的增加量为:用荧光检测仪每隔一段时间检测一次荧光,检测总时长为1-2小时;VKOR蛋白的活性=反应1小时的荧光值FT1-反应开始时的本底荧光值FT0。
9.如权利要求1-8中任一项所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法筛选出的小分子化合物及其结构类似物作为制备靶向维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的抑制剂的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述筛选出的小分子化合物及其结构类似物的结构式如下: