1.一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针,其特征在于:2-2-2-氯-3-(1,
3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物和四氮唑为反应原料,得到2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3-二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为荧光基团,该分子探针优选为2-[2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢)]-12氢-1,10-呋喃-(1,4,7,10-四氮唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚,其化学结构式为:
2.一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法,荧光分子探针具有权利要求1所述的结构,其特征在于,包括以下步骤:将2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物加入到烧瓶中,再加四氮唑,最后加入氯仿做为溶剂,70-90℃进行反应,反应结束,待溶液冷却到室温,柱层析法分离,得到产物2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3-二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为荧光基团,2-[2-(2,3,4,5,6,7,
8,9,13,14-十氢)]-12氢-1,10-呋喃-(1,4,7,10-四氮唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚,命名为F474。
3.根据权利要求2所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法,其特征是:所述2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物与四氮唑的摩尔比优选为1:5;
所述反应的时间优选为12h;
所述反应温度优选为80℃。
4.一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用,所述分子探针具有如权利要求1所述的结构,或通过权利要求2-3任一项所述的制备方法制备,其特征在于:应用于检测生物细胞内粘度以及应用于检测活细胞粘度变化及荧光成像。
5.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用,其特征是:建立分子探针F474对粘度的滴定线性曲线步骤包括,(1)配制pH=7.40,浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液;浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液;
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为:10:0,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9和0:10的溶液共10份,在试管内混和均匀,然后再分别加入10μL浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液,混合均匀,在荧光比色皿中完成测样;
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度,得到荧光强度比值,检测细胞粘度的荧光强度的激发波长为400nm;
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标,以荧光强度比值为纵坐标,得到关于粘度和荧光强度比值的线性方程。
6.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用,其特征是:检测分子探针F474在最小粘度和最大粘度的紫外吸收步骤包括,分别取甲醇与丙三醇比例为:10:0和0:10的溶液共2份,在试管内混均匀,然后再分别加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液,混合均匀,在比色皿中完成测样,得到两份样品的紫外吸收图谱。
7.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用,其特征是:检测分子探针F474对不同粘度的荧光寿命的步骤包括,(1)配制pH=7.40,浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液;浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液;
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为:10:0,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9和0:10的溶液共10份,在试管内混均匀,然后再分别加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液,混合均匀,在荧光比色皿中完成测样;
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度,得到荧光强度比值,检测细胞粘度的荧光强度的激发波长为400nm;
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标,以荧光强度比值为纵坐标,得到关于粘度、荧光强度比值的线性方程;得到分子探针F474对不同粘度的荧光寿命图。
8.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用,其特征是:分子探针F474对巨噬细胞成像的步骤包括,(1)配制浓度为1mM的分子探针F474的DMSO标准溶液,浓度为1μg/ml的莫能菌素溶液;
(2)细胞培养:将复苏好的巨噬细胞进行培养,培养基包含10%牛胚胎血清、1%双抗、
89%DMEM、在37℃,5%CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用;
(3)将活的巨噬细胞置入培养基中培育,共分别培养3组,每组培养基中接种量为2×107~9×107个/mL,培育24h,分成A,B和C三组,A组巨噬细胞只加入10μM的分子探针F474孵育
30min;B组巨噬细胞先使用15μM的莫能菌素培养30min,然后再用10μM的分子探针F474孵育
30min;C组细胞先使用2μM制霉菌素孵育30min,然后再用10μM的分子探针F474孵育30min,巨噬细胞共聚焦激光荧光成像,得到关于三组细胞的共聚焦图谱,得到关于三组细胞荧光图像的强度图。
9.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用,其特征是:检测分子探针F474对细胞存活率影响的步骤包括,细胞培养液中加入浓度分别为0M,5M,10M,20M,30M和50M的分子探针F474,在37℃,5%CO2的培养箱中培养24h,将25μL,5mg/mL的4-甲基噻唑基四唑MTT加入到细胞培养液中培养
4h,通过MTT比色皿法来评估细胞存活率,以不加分子探针F474的细胞组存活率为100%,不同浓度分子探针F474加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图。