1.一种用于估测鱼类死亡时间的引物,其特征在于包括以下4对扩增鱼类18S rRNA特定区域的引物:第一对引物的序列分别入SEQ ID NO.1-2所示:
SEQ ID NO.1:18S-1700-F:ACTTGGATAACTGTGGCAATTC;
SEQ ID NO.2:18S-1700-R:ACNGAAACCTTGTTACGA;
第二对引物的序列分别入SEQ ID NO.3-4所示:
SEQ ID NO.3:18S-1600-F:CGTTACTTGGATAACTGTGGC;
SEQ ID NO.4:18S-1600-R:CCGATCCGAGGACCTCACTAA;
第三对引物的序列分别入SEQ ID NO.5-6所示:
SEQ ID NO.5:18S-1600-F:GCCGCTTTGGTGACTCTAGAT;
SEQ ID NO.6:18S-1600-R:CGCTTACTGGGAATTCCTCGT;
第四对引物的序列分别入SEQ ID NO.7-8所示:
SEQ ID NO.7:18S-1600-F:AATGTCTGCCCTATCAACTTTC;
SEQ ID NO.8:18S-1600-R:ATCGCTCCACCAACTAAGAA。
2.一种利用18S rRNA片段PCR扩增检测估测鱼类死亡时间的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取与待检鱼类同类的样本死后不同冷藏时间点的肌肉组织,并进行总RNA共提取,然后进行cDNA合成;
2)以步骤1)合成的cDNA为模板,采用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增反应,进行电泳检测每个时间点中对应特定片长18S rRNA的cDNA模板的PCR扩增情况;
3)根据电泳结果,建立鱼类死亡时间与不同引物对扩增结果的对应关系,最后对待检鱼类进行检测以估测其死亡时间。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤1)中,所述不同冷藏时间点的间隔为1天。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤1)中,肌肉组织的提取方法为:将样本经麻醉处理后,迅速转移至0 1℃条件下进行冷冷藏保存处理,在各时间点,在各样本的背部~相似位置采集肌肉组织,置于无菌管中。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤1)中,总RNA共提取具体包括:将获得的肌肉组织置于离心管中,加入RNA isolater试剂,用手持匀浆机进行研磨,最后吸附柱吸附核酸并洗脱RNA,获得提取液。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤1)中,cDNA的合成反应具体包括:取所得的总RNA ,采用HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒进行反转录合成cDNA;先去除基因组DNA:4×gDNA wiper Mix 4μL、模板RNA 500 ng、RNase free ddH2O补足16μL,42℃、2min;后进行逆转录:5×HiScript® II qRT SuperMix II 4μL、去除基因组后的混合液16μL,50℃ 15min、85℃ 5s;得到的产物cDNA存于-20℃,便于后续PCR反应。
7.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤2)中,PCR扩增反应的PCR反应体系为:PCR反应预混液10 µL、cDNA模板或质粒模板0.5µL、上下游引物0.8 µL,最后用水补足至20 µL。
8.根据权利要求2或6所述的方法,其特征在于,步骤2)中,PCR扩增反应的反应体系如下:94℃预变性2 min;接30个循环:94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min;以及终延伸2 min。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤2)中,PCR扩增反应后,采用1% 琼脂糖凝胶电泳的方式检查扩增结果;PCR扩增产物的凝胶电泳上样量为5 -8 µL;电泳后的琼脂凝胶使用GelRed核酸染色剂进行染色,使用Bio-Rad凝胶成像系统中进行观察及拍照,获得电泳条带结果。