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专利号: 2020101274150
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法,其特征在于所述方法为:将含目的基因的蛹虫草重组菌接种至发酵培养基中,22~25℃,120~180rpm,摇床培养,获得含虫草多糖的发酵液;所述发酵培养基质量组成:2%葡萄糖,0.70%(NH4)2SO4,0.05%K2HPO4·3H2O,

0.05%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.10%L-甘氨酸,溶剂为蒸馏水,pH自然;所述目的基因为葡萄糖激酶基因gk、磷酸葡萄糖变位酶基因pgm或焦磷酸化酶基因ugp。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述葡萄糖激酶基因gk核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;磷酸葡萄糖变位酶基因pgm核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;焦磷酸化酶基因ugp核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述含目的基因的蛹虫草重组菌按如下方法制备:

将无菌纤维素薄膜密贴合在共培养固体培养基表面,然后将蛹虫草孢子悬液与含目的基因的农杆菌菌液等体积混合,涂布于无菌纤维素薄膜上,24℃恒温避光共培养48h后,将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基,纤维素薄膜紧密贴合无气泡,在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基,完全覆盖纤维素薄膜,22~25℃恒温避光培养;取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中,22~25℃恒温避光培养3~4d,筛选获得含目的基因的蛹虫草重组菌;所述共培养固体培养基为IM+200mmol·L-1乙酰丁香酮;所述选择培养基是IM+200mg·L-1潮霉素B+200mg·L-1头孢菌素+100mg·L-1卡那霉素;所述传代培养基是沙氏培养基+200mg·L-1潮霉素B。

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述蛹虫草孢子悬液浓度为106~108·mL-1。

5.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述蛹虫草孢子悬液按如下方法制备:将蛹虫草(Cordyceps militaris)接种至PDA培养基,24℃恒温避光培养7日,然后于超净工作台上用无菌水反复冲洗PDA培养基表面,得到蛹虫草菌悬液,4层纱布过滤菌悬液除去菌丝体,得到蛹虫草孢子悬液。

6.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述含目的基因的农杆菌菌液OD600=0.80。

7.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述含目的基因的农杆菌菌液按如下方法制备:将目的基因的农杆菌划线接种至固体细菌培养基,28℃恒温培养48h,再挑取单菌落接种至液体细菌培养基,180rpm、28℃恒温培养36h,然后将其接种到农杆菌预培养液体培养基中,180rpm、28℃恒温培养6~8h至菌体浓度OD600=0.80,得到农杆菌菌液;所述固体细菌培养基是LB固体+25mg·L-1利福平+50mg·L-1Kan卡那霉素;所述液体细菌培养基为LB液体+25mg·L-1利福平+50mg·L-1卡那霉素;所述农杆菌预培养液体培养基是IM+200mmol·L-1乙酰丁香酮。

8.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL-1。