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专利号: 2020101299340
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种生产L‑异亮氨酸谷氨酸棒状杆菌的工程菌的制备方法,其特征在于,所述方法是将L‑异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac,敲除基因alaT、brnQ,在此基础上敲除alr基因获得构建营养缺陷型系统,在该系统中回补alr基因并过表达基因ilvBN和ppnK;所述启动子tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述启动子ilvA的上游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述启动子ilvA的下游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述回补alr基因为通过外源过表达载体补入alr基因;

所述回补alr基因具体为将质粒pJYW‑4上原有的来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的alr片段去除得到线性化载体,将核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的alr片段连接至所述线性化载体,构建得到pYCW‑1,将核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的ilvBN和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的ppnK片段分别连接至pYCW‑1进行表达;

所述将L‑异亮氨酸工业生产菌WM001的启动子ilvA替换为启动子tac具体步骤为:扩增出启动子tac片段和启动子ilvA的上下游片段,将启动子ilvA的上游片段、tac启动子片段、启动子ilvA的下游片段依次连接构建获得启动子替换载体,再将所述替换载体转入WM001中,得到含启动子tac的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,(1)按照下述步骤敲除基因alaT:扩增如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的片段,分别用BamHI和XbaI酶、BamHI和XhoI酶、XbaI和EcoRI酶将扩增的片段依次连接至线性化载体,得到alaT基因敲除载体,将所述alaT基因敲除载体转入权利要求1所述含启动子tac的菌株,得到alaT基因敲除菌株;

(2)按照下述步骤敲除基因brnQ:扩增出如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的片段,分别用BamHI和XbaI酶、BamHI和XhoI酶、XbaI和EcoRI酶将扩增的片段依次连接至线性化载体得到brnQ基因敲除载体,再将所述brnQ基因敲除载体转入步骤(1)中得到的alaT基因敲除菌株中,得到alaT和brnQ双基因敲除菌株。

(3)按照下述步骤敲除基因alr:扩增出如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的片段,分别用BamHI和XbaI酶、BamHI和XhoI酶、XbaI和EcoRI酶将扩增的片段依次连接至线性化载体得到alr基因敲除载体,再将所述alr基因敲除载体转入步骤(2)得到的alaT和brnQ双基因敲除菌株中,得到营养缺陷型菌株。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,分别扩增得到基因alr、基因ilvBN和基因ppnK的片段,将扩增得到的3个片段整合至同一表达载体,得到共表达载体;将得到的共表达载体转入权利要求2构建得到的营养缺陷型菌株中,得到回补表达alr并过表达ilvBN和ppnK的菌株。

4.权利要求1~3任一所述方法制备得到的工程菌。

5.一种L‑异亮氨酸的生产方法,其特征在于,所述方法是以权利要求4所述工程菌为发酵菌株发酵生产L‑异亮氨酸。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,将权利要求4所述工程菌进行活化至形成菌苔,将菌苔放于种子培养基中25~35℃、180~220rpm培养16~20h,得到种子培养物;将培养物接入发酵培养基,使培养物在发酵培养基中的初始OD562为1.5~2.0,于25~35℃、

180~220rpm培养70~75h。

7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,将培养物以发酵培养基体积的0.5~1.5%的接种量接种至发酵培养基。

8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,在发酵期间控制pH为6.5~7.5,溶氧水平为18~32%,补加葡萄糖溶液以维持培养体系中葡萄糖浓度为18~32g/L。

9.权利要求4所述工程菌或权利要求5~8任一所述的L‑异亮氨酸的生产方法在工业、医疗、化妆品领域制备L‑异亮氨酸中的应用。