1.一种非诊断目的的基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法在检测大肠杆菌和沙门氏菌的应用,其特征在于,包括以下步骤:(1)从待检测样本中提取待检测基因组DNA;所述待检测样本中包含两个特定基因序列;
(2)以待检测基因组DNA为模板,在Cas9切口酶、sgRNA、带标记的引物和DNA聚合酶的作用下进行多重等温扩增,得多重扩增核酸产物;多重等温扩增工艺包括以下步骤:(a)以待检测基因组DNA为模板,采用Cas9切口酶分别与针对待检测基因组DNA的sgRNA在20 42℃水浴下反应20 30min,得到混合液;
~ ~
(b)在混合液中加入DNA聚合酶、带标记的引物、NEBuffer 2和dNTP,混合均匀后,在20~
42℃水浴下反应1 1.5h,即获得多重扩增核酸产物;所述带标记的引物包括第一引物和第~二引物,所述第一引物被生物素基团标记;所述第二引物被具有特异性抗体的小分子化合物标记;所述带标记的引物包括如SEQ,ID,NO.13和SEQ,ID,NO.14所示的序列,以及如SEQ,ID,NO.15和SEQ,ID,NO.16所示的序列;在针对大肠杆菌和沙门氏菌的第二引物上分别标记不同的小分子化合物;
(3)将多重扩增核酸产物滴加在免疫层析试纸上,所述免疫层析试纸设有2 条检测线和一条质控线,观察检测线和质控线的颜色,确定检测结果。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(3)中,所述检测线上涂有与第二引物所标记的小分子化合物相对应的特异性抗体;所述质控线上涂覆有生物素修饰的羊抗鼠IgG抗体。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(3)中,所述免疫层析试纸包括底板,及依次搭接粘合于底板上的样品垫、乳胶微球垫、NC膜和吸水垫;所述样品垫、乳胶微球垫、NC膜和吸水垫各层膜相邻处部分重叠;所述NC膜上包被有相互平行的2 条检测线和一条质控线,所述检测线靠近乳胶微球垫一侧,所述质控线远离乳胶微球垫而靠近吸水垫一侧;检测时,将多重扩增核酸产物滴加在样品垫上,并将样品垫部分浸入到流动缓冲液中。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜;所述NC膜为硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述乳胶微球垫包括膜本体,以及均匀涂覆于膜本体表面的链霉亲和素标记的乳胶微球颗粒涂层;所述膜本体为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(3)中,所述检测结果包括:当质控线和检测线同时显色或质控线与任意一条检测线显色,判定待检测样本中含有相应的待检测物;当只有质控线显色,判定待检测样本中不含有待检测物。
7.根据权利要求1‑6任一所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,所述待检测样本来源于动物细胞、植物细胞、微生物和病毒中的一种或几种。