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专利号: 2020102244114
申请人: 汪利平
专利类型:发明专利
专利状态:授权未缴费
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶,其特征在于,所述酶氨基酸序列(Chitinolyticbacter meiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)在第266位、第270位、第342位上发生突变,由原来的T、Y、K分别突变为S、I、M,构建方法包括以下步骤:

1)从NCBI上获得几丁质酶序列(Chitinolyticbacter meiyuanensis,GenBank:ATN3 

9892.1),交生物公司合成,采用HindⅢ酶切pET20b(+)质粒,设计PCR引物F:GCTCGAATTCGGATCATGTCGCAAATCAATCGCT,R:GAATTAATTCGGATCTTACTTGTTCATGTTGCCCAT,PCR反应结束后,加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中,37℃孵育15min,80℃孵育15min,将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化,酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收,溶于灭菌双蒸水中,将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀,加入In-Fusion酶,50℃反应15min,转化E.coli JM109,挑取阳性克隆,送生物公司测序,将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达,得到含有野生型序列质粒的基因工程菌;

2)质粒DNA的提取

将携带有质粒pET20b(+)/CmChi1的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度

100μg/ml)液体培养基中,于37℃,200r/min过夜培养后,使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒,具体操作按照说明书进行;

3)易错PCR扩增与突变文库的构建

以步骤二获得的质粒为模板,用Nco Ⅰ酶切使质粒线性化,设计引物CmChi1-F:ATTCCGATATCCATGATGTCGCAAATCAATCGCT和CmChi-R:CCGGCGATGGCCATGTTACTTGTTCATGTTGCCCAT,进行易错PCR扩增基因,易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer,dNTPs Mixture,引物各0.2μmol/L,模板DNA 200ng,Taq DNA聚合酶2.5U,PCR反应条件:95℃5min,94℃

1min,55℃1min,72℃2min,35个循环,72℃10min,Mn2+浓度0.5mmol/l,Mg2+浓度为7.0mmol/l,加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中,37℃孵育15min,80℃孵育15min,将pET20b(+)质粒用NcoⅠ酶切线性化,酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收,溶于灭菌双蒸水中,将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀,加入In-Fusion酶,50℃反应15min,转化E.coli BL21,涂布于固体LB平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子,所有转化子构成突变体文库;

4)突变文库的高通量筛选

从LB平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有300μl LB培养基(内含50μg/ml Amp)的96孔中,每孔对应一特定转化子,每块96孔板同时接种野生型克隆,作为阳性对照,37℃、

200r/min振荡培养12h,在无菌条件下,从96孔板中取出20μl菌液,4℃临时冷藏种子于96深孔板,25℃、200r/min振荡培养重组菌48h后,以每孔一一对应为原则,移取10μl菌液,对应涂布于以几丁质为唯一碳源的选择性固体培养基,35℃培养5d后,将比对照组透明圈大的克隆挑出并进行复筛;

5)将复筛通过的阳性克隆,送生物公司测序;

6)突变体的生产,将步骤五的含有突变质粒的E.coli BL21发酵培养;

7)突变体的纯化,采用分子筛的方法纯化突变体;

8)对突变体进行SDS-PAGE电泳;

9)采用Bradford测定蛋白质浓度。

2.根据权利要求1所述的用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶,其特征在于,所述酶用于提高乙酰氨基葡萄糖的生产率。