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专利号: 2020103143055
申请人: 河南科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于,包括如下步骤:

S1、选取对照组:选取自然生长的“峰早”葡萄和利用蒸馏水处理后的“巨峰”葡萄;

S2、实验组处理:将300mmol/L的H2O2均匀喷涂在“巨峰”葡萄上,其中,第一次喷施为开花后25天,第二次为开花后35天,每个过程重复三次,每次重复五棵树;

S3、收集材料:每次采样从上午9点开始,用锡纸包起来,立即放入液氮罐中;

S4、采集样本:每棵树随机抽取30个样本,记录果实发育的物候期数据,其中采样时间为葡萄果实发育关键时间点分别是2017年6月12日、6月21日、7月1日、7月12日;

S5、葡萄中GDSL型酯酶/脂肪酶基因家族鉴定;

S6、多序列比对和系统发育分析;

S7、葡萄中GELP基因的表达分析;

S8、RNA提取和实时荧光定量;

S9、与葡萄果实发育相关的候选VvGELP基因的筛选:

(1)采用TIANGEN试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总RNA;

(2)回收PCR产物;

(3)构建载体并与目的基因连接,将重组后的载体质粒转入大肠杆菌;

(4)利用ExPASy在线分析工具对VvGELP76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。

2.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:S5中,从Pfam网站中,下载GDSL型酯酶/脂肪酶结构域序列,利用隐马尔可夫模型软件HMMER进行比对搜索葡萄中的GELP基因,将得到的GELP基因蛋白序列用Clustalx进行比对建立新的HMM文件,然后利用HMMER软件搜索葡萄中GELP基因,将得到的基因提交到SMART和CDD网站进行结构认证,保留其中含有GELP保守结构域的的基因,数据处理中去掉重复基因以及基因中包含“N”的个数大于全长的30%的基因,并保留同一基因不同可变剪切中最长的氨基酸序列。葡萄基因组序列从EnsemblePlants数据库下载。利用ExPASy在线分析工具对葡萄GELP基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析。

3.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:S6中,用鉴定出的VvGELP基因蛋白序列与23个其他物种功能已知的GELP基因蛋白序列在MEGA7.0中构建系统发育树,并将参数设置为:homogeneous pattern;pairwise deletion;

bootstrap值1000。23个功能已知的GELP蛋白序列从UniProt数据库下载。

4.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:S7中,VvGELP基因的FPKM值来自RNA-seq数据,数据处理过程:计算每次生物学重复平均FPKM值,并取值log10,利用软件R将数据可视化。

5.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:S8中,用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒对H2O2处理和对照的“巨峰”以及未处理“峰早”果实提取RNA,随后用TaKaRa反转录试剂盒,反转录合成cDNA,作为模板用于PCR扩增。

6.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:在采用TIANGEN试剂盒提取“巨峰”葡萄和“峰早”葡萄的果实总RNA中,以总RNA为模版,反转录合成cDNA,利用Primer3设计特异性引物,克隆VvGELP76基因全长的引物序列为:VvGELP76Forward:AACTGTGGTCGTCTTCTCG,VvGELP76Reverse:CCACGCATTTCTGGATGATC,以反转录生成的cDNA为模板与基因的简并引物进行PCR扩增,PCR扩增,反应程序为:95℃预变性

3min;95℃20s,58℃30s,72℃30s,35个循环;最后,72℃延伸5min。

7.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:在回收PCR产物中,PCR扩增目的基因片段采用50μL体系,每个基因扩增两管,之后将相同两管PCR产物点进同一个胶孔内,切下目的基因位置凝胶,使用康为世纪胶回收试剂盒,回收胶之后立即进行T-A克隆。

8.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:在构建载体并与目的基因连接,将重组后的载体质粒转入大肠杆菌中,大肠杆菌转化需预先配置LB培养基,实际用量:细菌培养用胰蛋白胨0.5g、细菌培养用酵母提取物0.25g、氯化钠

0.5g、琼脂粉0.75g,50mL蒸馏水。

9.根据权利要求1所述的葡萄早熟相关GDSL型酯酶/脂肪酶标志基因,其特征在于:在利用ExPASy在线分析工具对VvGELP76基因编码的蛋白质进行氨基酸基本性质分析中,用SignalP-5.0进行信号肽分析,利用PSORT Prediction进行亚细胞定位预测,用TMHMM Server v.2.0进行跨膜结构域分析。