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专利号: 2020104143565
申请人: 西华大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种氧氟沙星灵敏检测的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含:纳米磁珠‑核酸适配体探针、RCA引物、RCA模板、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶和NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针;

其中,所述纳米磁珠‑核酸适配体探针以氨基化Fe3O4纳米颗粒为磁分离载体,在氨基化Fe3O4纳米颗粒表面上固定有核酸序列P1,且该核酸序列P1与核酸适配体通过碱基互补配对杂交;所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列;所述核酸适配体具有如SEQ.ID NO 2所示的核苷酸序列;

所述RCA引物具有如SEQ.ID NO 3所示的核苷酸序列;

所述RCA模板具有如SEQ.ID NO 4所示的核苷酸序列;

所述NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针包含:氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨纳米颗粒和可与RCA产物互补的核酸序列cDNA;所述核酸序列cDNA具有如SEQ.ID NO 5所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包含:T4 DNA 连接酶缓冲液、Phi29 DNA聚合酶缓冲液;所述T4 DNA连接酶缓冲液包含:Tris‑HCl buffer、MgCl2、二硫苏糖醇、ATP、PEG4000;所述Phi29 DNA聚合酶缓冲液包含:Tris‑HCl buffer、(NH4)2SO4、MgCl2、二硫苏糖醇。

3.一种用于检测氧氟沙星的探针组,其特征在于,该探针组包含:纳米磁珠‑核酸适配体探针和Phi29 DNA聚合酶和NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针;

其中,所述纳米磁珠‑核酸适配体探针以氨基化Fe3O4纳米颗粒为磁分离载体,氨基化Fe3O4纳米颗粒表面上固定有核酸序列P1,且该核酸序列P1与核酸适配体通过碱基互补配对杂交;所述核酸序列P1具有如SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列;所述核酸适配体具有如SEQ.ID NO 2所示的核苷酸序列;

所述NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针包含:氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒和与RCA产物互补的核酸序列cDNA;所述核酸序列cDNA具有如SEQ.ID NO 5所示的核苷酸序列。

4.一种氧氟沙星快速灵敏检测的方法,其特征在于,该方法采用如权利要求1或2所述的试剂盒进行检测。

5.根据权利要求4所述的氧氟沙星快速灵敏检测的方法,其特征在于,该方法包含:

将如权利要求1中所述的纳米磁珠‑核酸适配体探针分散在待测样品中振荡孵育,结束后进行磁分离,得到脱落核酸适配体后的纳米磁珠‑P1探针;

将所述纳米磁珠‑P1探针与如权利要求1中所述的RCA引物振荡孵育,加入如权利要求1中所述的RCA模板、T4 DNA连接酶缓冲液、水和T4 DNA连接酶,振荡孵育,结束后灭活所述T4 DNA连接酶,磁分离后加入Phi29 DNA聚合酶缓冲液、牛血清白蛋白、dNTPs、Phi29 DNA聚合酶和水进行孵育,结束后灭活所述Phi29 DNA聚合酶,得到反应产物纳米磁珠‑RCA;

将如权利要求1中所述的NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针和纳米磁珠‑RCA混合均匀并孵育,结束后进行磁分离,得到NaYF4:Ce/Tb‑cDNA‑RCA‑纳米磁珠复合物;

将所述NaYF4:Ce/Tb‑cDNA‑RCA‑纳米磁珠复合物进行荧光信号强度检测以检测待测样品中的氧氟沙星。

6.一种纳米磁珠‑核酸适配体探针的制备方法,其特征在于,该制备方法包含:

将氨基化Fe3O4纳米颗粒于PBS缓冲液中,加入戊二醛溶液,室温振荡孵育,分离得到活化的纳米材料,将该活化纳米材料于亲和素溶液中35 40 ℃孵育过夜,得到修饰亲和素的~纳米材料;

将所述修饰亲和素的Fe3O4纳米材料于PBS缓冲液中,加入如权利要求1中所述的核酸序列P1,35 40 ℃振荡孵育,得到纳米磁珠‑P1探针;

~

将所述纳米磁珠‑P1探针于经过淬火处理的核酸适配体的PBS缓冲液中,该核酸适配体为如权利要求1中所述的核酸适配体,35 40 ℃振荡孵育,得到纳米磁珠‑核酸适配体探针。

~

7.一种NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针的制备方法,其特征在于,该制备方法包含:将氨基化NaYF4:Ce/Tb时间分辨荧光纳米颗粒分散于PBS缓冲液中,加入戊二醛溶液,室温振荡孵育,离心分离得到活化的荧光纳米颗粒,将活化的荧光纳米颗粒于亲和素溶液中35‑40 ℃孵育,离心后得到修饰亲和素的荧光纳米颗粒;

将所述修饰亲和素的荧光纳米颗粒分散于PBS缓冲液中,加入如权利要求1中所述的核酸序列cDNA,35~40 ℃振荡孵育,得到NaYF4:Ce/Tb‑cDNA时间分辨荧光探针。