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专利号: 2020104315152
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,包括如下步骤:S1.组培苗培养

将生根的菊叶薯蓣组培苗去掉根后转接到继代培养基上预培养10~20天,获得外植体;

S2.转基因工程菌的准备

将活化后的发根农杆菌C58C1经扩大培养后制备感受态细胞,然后转入含目的基因的表达载体,再筛选、鉴定,得到转基因发根农杆菌C58C1工程菌;

S3.转基因侵染菌液的制备

将步骤S2的转基因发根农杆菌C58C1工程菌经进行扩大培养,OD600在0.5~0.6时,离心收集菌种,然后用含有乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基重悬菌体,至OD600在0.5~0.6,得到侵染菌液;

S4.侵染与共培养

将步骤S1的外植体于步骤S3的侵染菌液中侵染15~30min,侵染完毕后,移出外植体并去除外植体表面的液体,然后将外植体转接至含有乙酰丁香酮的MS固体培养基,于23~27℃黑暗共培养2~3天;

S5.毛状根的诱导

将外植体从共培养的培养基中取出,置于含有头孢噻肟钠抗生素无菌水中浸泡8~10分钟,然后用纯无菌水清洗2~4遍;待清洗完毕后将去除外植体表面的水分,然后将外植体转接至含有头孢噻肟钠的MS固体培养基中培养;

S6.毛状根的除菌培养

待外植体发根后12~16天,去掉外植体的茎、叶,将留下的毛状根转接到新的含头孢噻肟钠的MS固体培养基中,每两周转接一次,并且不断降低头孢噻肟钠的工作浓度直到为零;

S7.毛状根的液体扩大培养

将除菌培养后的毛状根从外植体分离成一条一条,然后接种到1/2MS液体培养基震荡培养。

2.根据权利要求1所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,还还包括转基因毛状根PCR检测:提取毛状根DNA,然后进行PCR鉴定,鉴定基因包括rol B、rol C以及转入的目的基因。

3.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,所述继代培养基为MS+0.05~0.3mg/L NAA+1.2~1.7mg/L 6-BA。

4.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,步骤S1预培养为23~27℃,光照强度1500~2500lx,每天光照时间14~18h,培养10~20天。

5.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,步骤S4所述侵染为26~30℃,130~160r/min震荡侵染15~30min。

6.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,步骤S3含有乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基及步骤S4中含有乙酰丁香酮的MS固体培养基中乙酰丁香酮浓度为100~600μmol/L。

7.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,步骤S5所述含有头孢噻肟钠抗生素无菌水和含有头孢噻肟钠的MS固体培养中头孢噻肟钠浓度为200~300mg/L。

8.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,步骤S5所述培养为于23~27℃,光照强度1500~2500lx,每天光照时间14~18h,培养3~5天。

9.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,步骤S6第一次转接的MS培养基中头孢噻肟钠的工作浓度为250mg/L,第二次转接的头孢噻肟钠工作浓度为100mg/L,最后将材料转接到不含Cef的MS固体培养基中。

10.根据权利要求1或2所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法,其特征在于,所述目的基因为GFP。