1.高产L‑高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌,由如下方法构建获得:
(1)将大肠杆菌E. coli W3110中metI、metJ、metB、thrB、metA和lysA基因敲除,并且过表达metL基因,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA ΔlysA Trc‑metL;
(2)以E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA ΔlysA Trc‑metL为出发菌株,用来源于pTrc99A的trc启动子替换ppc基因的启动子,敲除iclR基因,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc;
(3)将编码抗反馈抑制的丙酮酸羧化酶pyc突变基因、编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶融合蛋白的thrA突变基因和编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅲ的lysC突变基因导入菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc/pACP;所述pyc突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,thrA突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示;
(4)将编码蔗糖转运蛋白的scrA基因、编码蔗糖‑6‑磷酸水解酶的scrB基因和编码果糖激酶的scrK基因导入E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc/pACP,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc/pACP/pSCR,即所述高产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌;所述scrA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,所述scrB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,所述scrK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌,其特征在于所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
3.构建权利要求1所述高产L‑高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌的方法,所述方法包括:
(1)通过CRISPR‑Cas9介导的基因编辑方法,将大肠杆菌E. coli W3110中metJ、metI、metB、thrB、metA和lysA基因敲除,并且过表达metL基因,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA ΔlysATrc‑metL;
(2)以E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJΔmetBΔthrBΔmetA ΔlysA Trc‑metL为出发菌株,通过CRISPR‑Cas9介导的基因编辑方法,用序列如SEQ ID NO.12所示的trc启动子替换ppc基因的启动子,敲除iclR基因,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc;
(3)通过CRISPR‑Cas9介导的基因编辑方法,将序列如EQ ID NO.13所示的pyc突变基因、序列如SEQ ID NO.14所示的thrA突变基因和序列如SEQ ID NO.15所示的lysC突变基因导入菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc/pACP;
(4)通过CRISPR‑Cas9介导的基因编辑方法,将序列如SEQ ID NO.8所示的scrA基因、序列如SEQ ID NO.9所示的scrB基因和序列如SEQ ID NO.10所示的scrK基因导入E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc/pACP,构建得到菌株E. coli W3110 ΔmetI ΔmetJ ΔmetB ΔthrB ΔmetA ΔlysA ΔiclR Trc‑metL Trc‑ppc/pACP/pSCR,即所述产高丝氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
4.一株高产L‑高丝氨酸的基因工程菌——大肠杆菌ZJUT H‑2/AS(Escherichia coli ZJUT H‑2/AS),保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期2020年6月22日,保藏编号CCTCC NO:M 2020233,保藏地址为中国武汉,武汉大学,邮编430072。
5.如权利要求4所述大肠杆菌ZJUT H‑2/AS(Escherichia coli ZJUT H‑2/AS)在微生物发酵制备L‑高丝氨酸中的应用。