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专利号: 202010679049X
申请人: 河南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种棉花自交不育系构建用重组载体,其特征在于,所述重组载体包括:由棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建的柱头不亲和表达载体Ghstp‑PrsS‑pBI121,和由花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉管决定基因PrpS融合构建的花粉不亲和表达载体Ghpop‑PrpS‑pBI121;这两个重组载体以质粒pBI121为骨架载体构建获得;

所述棉花柱头特异启动子Ghstp,其碱基序列如SEQ ID No.1所示;

所述棉花花粉管特异启动子Ghpop,其碱基序列如SEQ ID No.2所示;

所述重组载体通过如下步骤构建获得:

(一)准备虞美人自交不亲和决定基因对

虞美人自交不亲和决定基因对PrsS和PrpS具体基因序列如下:

柱头决定基因PrsS:

ATGAACATATTTTATGTTATTGTGCTGCTATCGTTCTTCTTGTCCAAGTCAAGCGGTTTCTTTCCTGTTATTGAGGTGCGTATAATGAACAGAAGAGGTAACGGGAGGAGCATTGGCATCCATTGCCGATCCAAAGATAATGATCTTCAAAACCAAACAGTGACATCTGGTCATGACATGAGTTTTTCATTTAGGGAAGATTTTTTCCATACAACTCACTTCTATTGTGACCTACAATGGGATAAAGAAACAAAGTTCGGGTTTTATTCCTATCAGGCAAAGAGGGATGATGACGGTAGGTGCTCTTCCCAGTGCCTCTGGAAGATAATGGATGATGGTTTATACGGTTTTGATCAGGAGCATCAGATCTGGCAGATTTACCATTTGATAAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGTCGAACCTGA花粉管决定基因PrpS:

ATGCCCCGAAGTGGAAGTGTTGTTACTTTATTTCAGTTTGTTGGAGGATTATGTACCCTGTTGGGAGTCTCAGTTGCCATAAAAGCTATTTTTGCTCAAGATTATACATTGAAAGATCTCATTATCCTAATTGTATTAGTTGCACTGTCAATAATACTGGGAGGACCAATCACCCTCACATGTGTCAAACTACTTGGCTTGGTTTTACATCGTCTTAGCTTTTCAGAAGATCAAAAGTGGGTAGTCGCATTTGGGACTGCTGCAATCTGTGATGTTCTTCTGGTACCCAAAAATATGTTACCAATGACCATTTTTTCCTTCTTATCTTCCATAATGATCTGTGTGGTCGCTGTTGGTTGGGATTGCGACCGAAGTGGCATGACCGAAGGATTTTTGGTTGGGTTTGGCAAGCTTCTACTAGTATACTTGATCAAACAAGATTTTACTTTTTCATTGTTGTGTGGATCAGTTCTCTGCCTCGCAGTTGTTGCTAAGTTCACAGAAGGTAAGGCTGAAGCCACTCCAAATCCAAATCTCGCTGGAAAAGCGGATTCCCCTCATCTTATAACTCAAGCTTAA;

(二)分别构建柱头不亲和表达载体Ghstp‑PrsS‑pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop‑PrpS‑pBI121以Hind III和BamH I作为酶切位点,分别对质粒pBI121和含有Ghstp或Ghpop基因的pMD19质粒进行双酶切,并回收酶切片段,再利用T4 DNA酶进行连接,进一步转化、筛选后提取质粒进行验证,以确保重组构建正确;

重组过程中,以启动子Ghstp或Ghpop替换质粒pBI121中原始35S启动子,从而构建获得Ghstp‑pBI121或Ghpop‑pBI121这一中间质粒载体;

再以BamH I和Sac I作为酶切位点,对构建正确的Ghstp‑pBI121或Ghpop‑pBI121这一中间质粒载体和含有PrsS或PrpS的pMD19质粒分别进行双酶切,并回收酶切片段,再利用T4 DNA酶进行连接,进一步热激法转化Trans‑T1感受态细胞,涂布、筛选,挑取阳性克隆进行验证,以确保重组构建正确;

重组过程中,以PrsS或PrpS代替中间质粒载体Ghstp‑pBI121或Ghpop‑pBI121中的GUS基因,从而构建获得柱头不亲和表达载体Ghstp‑PrsS‑pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop‑PrpS‑pBI121。

2.如权利要求1所述棉花自交不育系构建用重组载体,其特征在于,PCR扩增制备所述棉花柱头特异启动子Ghstp和所述棉花花粉管特异启动子Ghpop时,引物序列设计为:Ghstp‑F:5’‑CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATT‑3’,

Ghstp‑R:5’‑CATTTTTTTTGAAGATGGAAAATGAATGAG‑3’;

Ghpop‑F:5’‑TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAA‑3’,

Ghpop‑R:5’‑TTGTGGTTGATGACTTCATCTTCCTCAAAT‑3’。

3.利用权利要求1所述重组载体的棉花自交不育系的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:

(一)利用组织培养技术,准备棉花无菌幼苗备用;

(二)以分别含有柱头不亲和表达载体Ghstp‑PrsS‑pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop‑PrpS‑pBI121的农杆菌菌液作为侵染液,分别侵染步骤(一)中无菌幼苗的下胚轴;

(三)将步骤(二)中侵染后下胚轴进一步培育形成愈伤组织,并进一步诱导分化、形成再生苗;

(四)进一步筛选、鉴定获得含有目的基因片段PrpS或PrsS的纯合株系。

4.如权利要求3所述棉花自交不育系的构建方法,其特征在于,步骤(一)中,所采用的棉花品种为棉花Z24。