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专利号: 202010679049X
申请人: 河南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.棉花柱头特异启动子Ghstp,其特征在于,启动子Ghstp长度为2003bp,具体碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.棉花花粉管特异启动子Ghpop,其特征在于,启动子Ghpop长度为2001bp,具体碱基序列如SEQ ID No.2所示。

3.PCR扩增权利要求1所述棉花柱头特异启动子Ghstp和权利要求2所述棉花花粉管特异启动子Ghpop用引物序列,其特征在于,具体如下:Ghstp-F:5’-CTTTATAGTACCCAAAATTATTCTATT-3’,

Ghstp-R:5’-CATTTTTTTTGAAGATGGA AAATGAATGAG-3’;

Ghpop-F:5’-TAATCTAACCCATTAGTGAATGAGGCAA-3’,

Ghpop-R:5’-TTGTGGTT GATGACTTCATCTTCCTCAAAT-3’。

4.利用权利要求1所述棉花柱头特异启动子Ghstp和权利要求2所述棉花花粉管特异启动子Ghpop所构建的重组载体,其特征在于,包括:由棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建的柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121,和由花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉决定基因PrpS融合构建的花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121;这两个重组载体以质粒pBI121为骨架载体构建获得,具体构建获得步骤为:(一)准备虞美人自交不亲和决定基因对

虞美人自交不亲和决定基因对PrsS1和PrpS1具体基因序列如下:

柱头决定基因PrsS:

ATGAACATATTTTATGTTATTGTGCTGCTATCGTTCTTCTTGTCCAAGTCAAGCGGTTTCTTTCCTGTTATTGAGGTGCGTATAATGAACAGAAGAGGTAACGGGAGGAGCATTGGCATCCATTGCCGATCCAAAGATAATGATCTTCAAAACCAAACAGTGACATCTGGTCATGACATGAGTTTTTCATTTAGGGAAGATTTTTTCCATACAACTCACTTCTATTGTGACCTACAATGGGATAAAGAAACAAAGTTCGGGTTTTATTCCTATCAGGCAAAGAGGGATGATGACGGTAGGTGCTCTTCCCAGTGCCTCTGGAAGATAATGGATGATGGTTTATACGGTTTTGATCAGGAGCATCAGATCTGGCAGATTTACCATTTGATAAAGAAAGAAAGGAAGGAAGGTCGAACCTGA花粉管决定基因PrpS:

ATGCCCCGAAGTGGAAGTGTTGTTACTTTATTTCAGTTTGTTGGAGGATTATGTACCCTGTTGGGAGTCTCAGTTGCCATAAAAGCTATTTTTGCTCAAGATTATACATTGAAAGATCTCATTATCCTAATTGTATTAGTTGCACTGTCAATAATACTGGGAGGACCAATCACCCTCACATGTGTCAAACTACTTGGCTTGGTTTTACATCGTCTTAGCTTTTCAGAAGATCAAAAGTGGGTAGTCGCATTTGGGACTGCTGCAATCTGTGATGTTCTTCTGGTACCCAAAAATATGTTACCAATGACCATTTTTTCCTTCTTATCTTCCATAATGATCTGTGTGGTCGCTGTTGGTTGGGATTGCGACCGAAGTGGCATGACCGAAGGATTTTTGGTTGGGTTTGGCAAGCTTCTACTAGTATACTTGATCAAACAAGATTTTACTTTTTCATTGTTGTGTGGATCAGTTCTCTGCCTCGCAGTTGTTGCTAAGTTCACAGAAGGTAAGGCTGAAGCCACTCCAAATCCAAATCTCGCTGGAAAAGCGGATTCCCCTCATCTTATAACTCAAGCTTAA;

以Hind III和BamH I作为酶切位点,分别对质粒pBI121和含有Ghstp或Ghpop基因的pMD19质粒进行双酶切,并回收酶切片段,再利用T4 DNA酶进行连接,进一步转化、筛选后提取质粒进行验证,以确保重组构建正确;

重组过程中,以启动子Ghstp或Ghpop替换质粒pBI121中原始35S启动子,从而构建获得Ghstp- pBI121或Ghpop- pBI121这一中间质粒载体;

再以BamH I和Sac I作为酶切位点,对构建正确的Ghstp-pBI121或Ghpop- pBI121这一中间质粒载体和含有PrsS1或PrpS1的pMD19质粒分别进行双酶切,并回收酶切片段,再利用T4 DNA酶进行连接,进一步热激法转化Trans-T1感受态细胞,涂布、筛选,挑取阳性克隆进行验证,以确保重组构建正确;

重组过程中,以PrsS1或PrpS1代替中间质粒载体Ghstp-pBI121或Ghpop- pBI121中的GUS基因,从而构建获得柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS1-pBI121。

5.利用权利要求4所述重组载体的棉花自交不育系的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:

(一)利用组织培养技术,准备棉花无菌幼苗备用;

(二)以分别含有柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉管自交不亲和表达载体Ghpop-PrpS1-pBI121的农杆菌菌液作为侵染液,分别侵染步骤(一)中无菌幼苗的下胚轴;

(三)将步骤(二)中侵染后下胚轴进一步培育形成愈伤组织,并进一步诱导分化、形成再生苗;

(四)进一步筛选、鉴定获得含有目的基因片段PrpS1或PrsS1的纯合株系。

6.如权利要求5所述棉花自交不育系的构建方法,其特征在于,步骤(一)中,所采用的棉花品种为棉花Z24。

7.一种利用外源自交不亲和性的棉花育种方法,其特征在于,首先构建由棉花柱头特异启动子Ghstp和虞美人自交不亲和柱头决定基因PrsS融合构建的柱头不亲和表达载体Ghstp-PrsS-pBI121,和由花粉管特异启动子Ghpop和虞美人自交不亲和花粉决定基因PrpS融合构建的花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121;再利用农杆菌介导转化技术,分别将棉花柱头特异表达载体Ghstp-PrsS1-pBI121和花粉不亲和表达载体Ghpop-PrpS-pBI121导入受体棉花,进一步筛选获得稳定纯合的自交不亲和柱头决定基因与花粉决定基因转基因株系Gh-PrpS和Gh-PrsS;

所述转基因株系Gh-PrpS和Gh-PrsS自交不能发育,或者当以转基因株系Gh-PrsS为母本、以转基因株系Gh-PrpS为父本时,也不能发育成铃。