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专利号: 2020108129251
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-11-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种酪氨酸磷酸酶生物传感器,其特征是,包括磁珠、肽‑DNA偶联物、DNA模板、信号探针、胰凝乳蛋白酶、Vent(exo‑)DNA聚合酶、切口酶Nb.BbvCI;

所述肽‑DNA偶联物包括肽链和第一DNA序列,肽链一端连接第一DNA序列的5'端,肽链含有磷酸化的酪氨酸;肽链另一端设置为用于连接磁珠;

所述DNA模板从5'端至3'端由两个第二DNA序列和一个第三DNA序列组成,第三DNA序列与第一DNA序列能够互补,DNA模板与第一DNA序列杂交再聚合后能够形成具有两个切口酶识别位点的双链DNA,第二DNA序列的互补链为脱氧核酶;

所述信号探针为核苷酸序列,所述核苷酸序列能够与脱氧核酶互补;所述脱氧核酶为在二价阳离子依赖性反应中裂解互补的RNA序列;

所述酪氨酸磷酸酶为蛋白质酪氨酸磷酸酶1B;

肽‑DNA偶联物的序列为:Lys‑Gly‑Asp‑Gly‑Val‑pTyr‑Ala‑Ala‑Cys‑GGA TCG TCA TGT ACG GCA GCT;

DNA模板的序列为:CAT GAG ATT CGT TGT AGC TAG CCT CAA CCC TCA GCC ATG AGA TTC GTT GTA GCT AGC CTC AAC CCT CAG CTG CCG TAC ATG ACG ATC C;

信号探针的序列为:CAT GAG A(Cy3)TrA rUTC AAC CC(BHQ2)T C;在信号探针中,带下划线的两个碱基“T”表示该碱基分别被Cy3和BHQ2修饰,碱基rA和rU分别表示腺嘌呤核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸。

2.如权利要求1所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器,其特征是,肽‑DNA偶联物通过链霉亲和素与生物素的结合与磁珠连接。

3.一种酪氨酸磷酸酶的检测方法,其特征是,所述检测方法不包括疾病的诊断和治疗,提供权利要求1 2任一所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器;

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将表面连接肽‑DNA偶联物的磁珠与含有酪氨酸磷酸酶的溶液进行去磷酸化反应,向去磷酸化反应后的体系中添加胰凝乳蛋白酶进行裂解反应,裂解反应后进行磁分离去除磁珠获得裂解产物,将裂解产物与DNA模板、信号探针在二价阳离子作用下进行三级DNA扩增反应,对三级DNA扩增反应后的溶液体系进行荧光检测。

4.如权利要求3所述的酪氨酸磷酸酶的检测方法,其特征是,磷酸化反应的反应温度为

35 40 °C,反应时间为1.5 2.5h;

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或,裂解反应的反应温度为35 40 °C,反应时间为1.5 2.5h;

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或,三级DNA扩增反应的过程为,先使裂解产物与DNA模板形成双链DNA,然后添加DNA聚合酶和切口酶进行链置换扩增反应,向链置换扩增反应后的体系中添加信号探针进行孵育,所述DNA聚合酶为Vent(exo‑)DNA聚合酶,所述切口酶为Nb.BbvCI。

5.如权利要求4所述的酪氨酸磷酸酶的检测方法,其特征是,双链DNA的条件为:先在95

100 °C下加热4 6分钟,然后冷却至室温。

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6.如权利要求4所述的酪氨酸磷酸酶的检测方法,其特征是,链置换扩增反应的条件为:温度为50 60 °C,时间为50 70min。

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7.如权利要求4所述的酪氨酸磷酸酶的检测方法,其特征是,孵育温度为35 40  °C,孵~育时间为1.5 2.5h。

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8.一种权利要求1 2任一所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器在制备检测酪氨酸磷酸酶试~剂中的应用。

9.一种权利要求1 2任一所述的酪氨酸磷酸酶生物传感器或权利要求3 7所述的酪氨~ ~酸磷酸酶的检测方法在筛选酪氨酸磷酸酶抑制剂中的应用。

10.一种酪氨酸磷酸酶检测试剂盒,其特征是,包括权利要求1 2任一所述的酪氨酸磷~酸酶生物传感器、镁盐、缓冲液。