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专利号: 202010837126X
申请人: 桂林医学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒,其特征在于,是由表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白和3CD蛋白酶的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后所得,所述表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白和3CD蛋白酶的重组杆状病毒的制备方法是:

将经过密码子优化的柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和经过密码子优化的3CD蛋白酶基因,与昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5连接,得到pOET5‑CB5‑P1‑3CD重组质粒;

然后将上述pOET5‑CB5‑P1‑3CD重组质粒与昆虫杆状病毒基因组flashBAC DNA共同转染Sf9昆虫细胞,培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后,获得表达柯萨奇病毒B5型的P1衣壳蛋白和3CD蛋白酶的重组杆状病毒;

其中,所述经过密码子优化的衣壳蛋白P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述经过密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1:制备pOET5‑CB5‑P1‑3CD重组质粒分别合成经过密码子优化的柯萨奇病毒B5型的衣壳蛋白P1基因和经过密码子优化的

3CD蛋白酶基因,然后分别连接到昆虫杆状病毒的穿梭载体pOET5的P10启动子之后的EcoRⅠ/NotⅠ酶切位点以及Ph启动子之后的BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切位点,得到pOET5‑CB5‑P1‑3CD重组质粒;

其中,所述经过密码子优化的衣壳蛋白P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述经过密码子优化的3CD蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;

步骤2:制备重组昆虫杆状病毒

取步骤1得到的pOET5‑CB5‑P1‑3CD重组质粒,与昆虫杆状病毒基因组flashBAC DNA共同转染Sf9昆虫细胞,培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后,收集上清液;再感染对数生长期的Sf9昆虫细胞,培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后,得到重组昆虫杆状病毒;

步骤3:制备和纯化病毒样颗粒

取步骤2得到的重组昆虫杆状病毒,感染Sf9昆虫细胞,培养至90%以上数量的所述Sf9昆虫细胞感染病变后,收集上清液并对上清液进行纯化,即得到柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

3.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法,其特征在于,步骤2中,所述培养的温度为27℃,时间为4d‑5d。

4.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法,其特征在于,步骤3中,所述重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞的感染复数MOI为5。

5.根据权利要求2所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法,其特征在于,步骤3中,所述培养的温度为27℃,摇速为100转/min,时间为3d。

6.根据权利要求2‑5任一项所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒的制备方法,其特征在于,步骤3中,所述纯化的具体方法是:步骤3.1:上清液浓缩

将上清液与质量百分浓度为20%的PEG8000、2.5M的NaCl溶液等体积混合,4℃搅拌过夜,再8000转/min离心30 min,弃掉上清液,留蛋白沉淀,使用TEN缓冲液重悬上述蛋白沉淀,得到病毒浓缩液;所述TEN缓冲液中含有0.01M Tris、0.01M EDTA和0.1M NaCl,pH值为

7.6‑8.0;

步骤3.2:蔗糖密度梯度超速离心

分别制备质量百分浓度为30%、45%、60%及80%的蔗糖溶液,对步骤3.1得到的病毒浓缩液进行密度梯度超速离心,290,000转/min离心4 h,收集位于45%与60%交界处的乳白色物质,即为柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒。

7.一种柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗,其特征在于,由权利要求1所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒为活性成分或活性成分之一。

8.根据权利要求7所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗,其特征在于,所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗的剂型为液体注射剂、注射粉剂和注射片剂中的任意一种或几种。

9.根据权利要求7所述的柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗,其特征在于,所述柯萨奇病毒B5型病毒样颗粒疫苗还包括佐剂,所述佐剂选自油佐剂、铝盐、水包油佐剂、油包水佐剂和水包油包水佐剂中的任意一种或几种。