1.一种筛选产醛或酮类风味物质细菌的高通量方法,其特征在于,所述方法包括:收集、染色和分选发酵中的未经卷制的雪茄烟叶上的微生物,然后通过测定微生物产物中的醛/酮物质的浓度和鉴定醛/酮物质的种类来验证筛选效果,筛选的菌株经过培养后醛酮物质产量在50‑300μg/mL,代谢产物中的醛酮类物质为苯甲醛、异佛尔酮、2,4‑二甲基苯甲醛、羟基丙酮、苯乙醛、香草醛和异戊醛,即表示该方法可以有效的用于产醛酮类风味物质菌株的分离和筛选;
所述方法具体步骤如下:
(1)称取烟叶并加入灭菌的生理盐水或中性的磷酸盐缓冲液,振荡分离烟叶和微生物,离心收集微生物;
(2)将收集的微生物复溶后加入荧光染料cy5‑hydrazide,在暗处染色;
(3)差速离心分离微生物和未结合的染料,先通过荧光显微镜检测菌株的染色情况,然后通过流式细胞仪将被荧光标记的菌株分选至装有YH培养基的96深孔板中进行培养;所述YH培养基成分为:葡萄糖20 g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨20 g/L,大豆蛋白胨10g/L ,MgSO4
0.5 g/L,KH2PO4 1 g/L,CaCl2 0.2 g/L;
(4)通过2,4‑硝基苯肼测定培养基中醛酮化合物的含量,再使用GC‑MS鉴定产物的种类;
(5)然后基于16s rRNA鉴定筛选微生物的种类。
2.如权利要求1所述的一种筛选产醛或酮类风味物质细菌的高通量方法,其特征在于,所述步骤(1)中烟叶上微生物的收集是称取1‑5 g烟叶,以1:40‑50(g/v)比例加入灭菌的生理盐水或中性的磷酸缓冲液,以 200‑250 rmp转速振荡1‑2 h,然后分离烟叶碎片和微生,以4000‑5000 rmp的转速收集微生物。
3.如权利要求1所述的一种筛选产醛或酮类风味物质细菌的高通量方法,其特征在于,所述步骤(2)中微生物的染色是先加入1‑2 mL的缓冲液重悬微生物,然后加入荧光染料cy5‑hydrazide至体系中,染料浓度为1‑2 mg/mL,并在暗处染色1‑2 h。
4.如权利要求1所述的一种筛选产醛或酮类风味物质细菌的高通量方法,其特征在于,所述步骤(3)中的培养为条件,在35‑45℃,600‑800 rpm培养36‑48 h。
5.如权利要求1所述的一种筛选产醛或酮类风味物质细菌的高通量方法,其特征在于,所述步骤(4)醛酮类化合物浓度测定方法是取50 µL培养上清中加入50 µL 2,4‑硝基苯肼,静置反应30 min,再加入500 µL KOH和400 µL去离子水,在500 nm处测定吸光度值,所述KOH的浓度为1 mol/L。
6.如权利要求1所述的一种筛选产醛或酮类风味物质细菌的高通量方法,其特征在于,所述步骤(4)中醛酮化合物的鉴定方法是取500 µL培养上清在液氮中冷冻后,在真空冷冻机中进行冷冻干燥,然后加入500 µL无水乙醇进行复溶,再加入500 µL丙酮去除蛋白,然后再使用GC‑MS鉴定化合物。
7.如权利要求1‑6任一所述方法在筛选产醛酮类细菌中的应用。