1.一种细胞色素P450酶,其特征在于:细胞色素P450酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种由权利要求1的细胞色素P450酶的编码基因构建的重组载体,其特征在于:为质粒pET28b(+)‑细胞色素P450。
3. 一种由权利要求2所述重组载体转化制备的重组基因工程菌,其特征在于:为重组大肠杆菌 BL21(DE3)‑pET28b(+)‑细胞色素P450。
4.如权利要求3所述的重组基因工程菌的制备方法,其特征在于依次进行如下步骤:(1)将细胞色素P450酶的编码基因克隆至外源基因表达质粒上,获得重组质粒;
(2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞,接种至LB液体培养基,20 37℃、50 250r/~ ~
min振荡培养0.5 2h,获得转化产物;
~
(3)将转化产物涂布于含50 μg/mL 卡那霉素的平板, 20 37℃培养,筛选获得含细胞~
色素P450酶编码基因的重组基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌的制备方法,其特征在于:所述外源基因表达质粒为下列之一:①pET系列,②pUC系列,③pGEM系列,④pBluescript系列。
6.如权利要求1所述细胞色素P450酶的用途,其特征在于:降解二氯甲烷。
7.根据权利要求6所述的细胞色素P450酶的用途,其特征在于:将含细胞色素P450酶编码基因的工程菌经发酵培养,得发酵液;
将发酵液中提取的细胞色素P450酶与PBS缓冲液混合,加入底物二氯甲烷、辅酶构成反应体系,在25 45℃反应完全,所述反应体系中,缓冲液pH为5 10;所述反应体系中,辅酶浓~ ~
度为0.1 0.5g/L。
~
8.如权利要求6或7所述的用途,其特征在于所述细胞色素P450酶按如下方法制备:(1)将含细胞色素P450酶编码基因的工程菌接种至LB固体培养基,在20 37℃下活化后~
接入LB液体培养基,在20 37℃、50 250 r/min 培养8 48 h后,以体积浓度0.1% 20%接种量~ ~ ~ ~
转入发酵培养基,20 37℃、50 250 r/min 培养至OD600达到0.4‑1.0后,加入诱导剂IPTG,~ ~
IPTG终浓度0.01 1.51 mM,在20 37℃、50 250 r/min 培养4 48 h后,获得发酵液;
~ ~ ~ ~
(2)将发酵液离心取菌体,用pH 7的PBS缓冲液洗涤之后,加入PBS缓冲液混匀,在工作3秒暂停2秒循环99次的条件下超声破碎后,离心收集上清;将细胞破碎液离心所得的上清液与binding buffer按1:1的体积比混合,加入镍柱中与填料混匀,并以每小时柱体积的10倍的流速流出;用15倍柱体积的binding buffer洗涤柱子,以洗去被污染的蛋白质;用5倍柱体积的elution buffer洗脱,收集洗脱峰,获得纯酶溶液。