1.一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体,其特征在于:所述的单克隆抗体为杂交瘤细胞株5A9所分泌;所述的杂交瘤细胞株5A9由猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白免疫原多次免疫小鼠而得到;所述的杂交瘤细胞株5A9于2020年09月01日保藏于中国典型培养物保藏中心,菌株保藏编号为CCTCC NO:C2020148。
2.根据权利要求1所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体,其特征在于:所述的猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白免疫原,由重组表达载体转化入E.coli BL21感受态中进行诱导表达而得到;所述重组nsp13蛋白免疫原的氨基酸序列组成如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体,其特征在于:所述的重组表达载体,包含一对扩增nsp13基因全长的引物;所述nsp13基因全长为
1791bp,其核苷酸序列组成如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体,其特征在于:所述引物包含上游引物nsp13-F和下游引物nsp13-R;所述nsp13-F序列为5’-TTTCTCGAGtctgcagggctttgtgttgt-3',酶切位点为Xho I;所述nsp13-R序列为5’-CCGGAATTCttactgcaaatcagac-3',酶切位点为EcoR I。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备,其特征在于,包含以下制备步骤:S1、构建重组表达载体:设计引物,扩增得到nsp13目的基因,将其克隆到pET-28a原核载体上,得到重组表达载体pET-28a-nsp13;
S2、获得免疫原:将上述S1步骤得到的pET-28a-nsp13重组表达载体,转入E.coli BL21感受态中进行诱导表达,得到猪流行性腹泻病毒重组nsp13包涵体蛋白,再经SKL溶解透析复性得到可溶性重组蛋白nsp13,作为后续单克隆抗体的免疫原;
S3、获得单克隆杂交瘤细胞株:将所述S2步骤得到的的免疫原多次免疫小鼠,取免疫的小鼠脾脏细胞,与SP2/0瘤细胞融合,筛选获得分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株;
S4、得到单克隆抗体:将所述S3步骤得到的单克隆杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,小鼠腹部胀大后,采集腹水,即得抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备,其特征在于,S1步骤中所述的引物设计为:根据猪流行性腹泻病毒CH/JX/01/P30株核苷酸序列信息,设计一对扩增nsp13基因全长的引物;S1步骤中所述的扩增为:对猪流行性腹泻病毒CH/JX/01/P30株,提取病毒基因组RNA,反转录合成cDNA,用引物nsp13-F,nsp13-R扩增全长nsp13基因。
7.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备,其特征在于,S2步骤中所述的诱导表达为:将扩增后的全长nsp13基因克隆到pET-28a原核和pCAGGS-HA真核表达载体上,经酶切与测序鉴定,命名为pET-28a-nsp13和pCAGGS-HA-nsp13;将pET-28a-nsp13质粒转入E.coli BL21感受态细胞中,得到重组nsp13包涵体蛋白;
S2步骤中所述的SKL溶解透析复性为:对重组nsp13包涵体蛋白,使用SKL溶解该包涵体后,经过透析复性获得可溶性重组蛋白nsp13。
8.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备,其特征在于,S3步骤中所述的用免疫原多次免疫小鼠为:将纯化后的重组蛋白nsp13作为免疫原,四次免疫6周龄雌性BABL/c小鼠;所述的与SP2/0瘤细胞融合为:采用有限稀释法将单克隆杂交瘤细胞经3次亚克隆,选取分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞;所述的杂交瘤细胞为杂交瘤细胞株5A9。
9.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备方法,其特征在于,S4步骤中所述的注入小鼠腹腔-采集腹水为:将S3步骤得到的能分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞,按每只小鼠106个细胞,注入8周龄BABL/c小鼠的腹腔进行免疫,7天后采取小鼠腹水,获得单克隆抗体。
10.根据权利要求1-4任一所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体在制备猪流行性腹泻病毒nsp13的Western Blot检测试剂中的应用。