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专利号: 2020111287513
申请人: 东北林业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种YPB肽段,其序列为P-P-R-K-K-K-R-K-H-R-L-W-A-A-H-C-R-K-I-Q-L-K-K-D-G-S-S。

2.如权利要求1所述的YPB肽段的应用,其特征在于通过YPB肽段与TAT和GGG合成,再标记上带有荧光的FITC,得到FITC-TAT-GGG-YPB多肽;所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽用于阻遏YY1和EZH2的结合,进而抑制乳腺癌细胞增殖及肿瘤的生长。

3.根据权利要求2所述的YPB肽段的应用,其特征在于所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽的序列为FITC-YGRKKRRQRRR-GGG-PPRKKKRKHRLWAAHCRKIQLKKDGSS。

4.如权利要求2所述的YPB肽段的筛选及FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法,其特征在于该方法按以下步骤进行:

一、利用大肠杆菌表达His×6-YY1蛋白并进行纯化;将EZH2功能区域分为4个片段,构建GST-融合蛋白,并利用大肠杆菌进行蛋白表达和纯化,得到纯化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白;

二、通过胺类偶合法将纯化后的His×6-YY1蛋白偶联到偶联用芯片上,然后利用生物大分子互作仪分别测定纯化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白与His×6-YY1蛋白的结合程度,经过筛选,得到EZH2上一段负责与YY1的结合序列,将这一段序列命名为YPB肽段,其序列为P-P-R-K-K-K-R-K-H-R-L-W-A-A-H-C-R-K-I-Q-L-K-K-D-G-S-S;最后将YPB肽段与TAT和GGG合成,再标记上带有荧光的FITC,得到FITC-TAT-GGG-YPB多肽;所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽的序列为FITC-YGRKKRRQRRR-GGG-PPRKKKRKHRLWAAHCRKIQLKKDGSS。

5.根据权利要求4所述的YPB肽段的筛选及FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法,其特征在于步骤一中所述利用大肠杆菌表达His×6-YY1蛋白并进行纯化的步骤如下:(1)将YY1连接到pHis×6的原核表达载体上,构建得到pHis×6-YY1表达载体;将pHis×6-YY1表达载体转入到大肠杆菌BL21 Tuners菌株内,在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,在37℃的摇床中以220rpm的转速过夜培养;将过夜培养后的菌液按1:50的比例加入到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,在37℃下培养2h~3h;

(2)将步骤(1)培养后的菌液降至16℃,加入浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,在16℃下继续培养6h~8h或过夜;将菌液在4,000×g、4℃下离心20min,收集细菌,然后用25mL的缓冲液I重悬,缓冲液I由20mM Tris·HCl、200mM NaCl、1mM DTT和pH7.5、1×蛋白酶抑制剂组成;将装有菌液的离心管在冰水的环境下进行超声波处理,每处理30s间歇

1min,直至菌体完全裂解;用20,000×g在4℃下离心30min,保留上清液,将上清液与1mL带有镍的树脂混合,在4℃下滚动结合2h,然后将树脂装入层析柱,先用20mM的咪唑洗涤层析柱两次、每次10mL,然后用40mM的咪唑洗涤层析柱两次、每次10mL,再用200mM的咪唑洗脱层析柱10次、每次200μL,得到含有His×6-YY1的洗脱样品;

(3)将含有His×6-YY1的洗脱样品合并,在4℃条件下进行透析,每隔5小时更换一次透析液,共更换三次透析液,透析液由1.5M NaCl、0.05M Tris-HCl和1mM DTT组成,pH为7.5;

将透析后的样品分装后冻存于-80℃下。

6.根据权利要求4所述的YPB肽段的筛选及FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法,其特征在于步骤一中所述将EZH2功能区域分为4个片段,构建GST-融合蛋白,并进行蛋白表达和纯化,其步骤如下:(1)将EZH2的4个片段的编码序列分别连接到pGEX-4T-1表达载体上,构建得到pGEX-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4表达载体,分别将pGEX-EZH2-Mut1、2、3和4表达载体转入到大肠杆菌BL21 Tuners菌株内,在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,在37℃的摇床中以

220rpm的转速过夜培养;将培养后的菌液按1:50的比例加入到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中,在37℃下培养2h~3h;

(2)将步骤(1)培养后的菌液降至16℃,加入浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,在16℃下继续培养6h~8h或过夜;将菌液在4,000×g、4℃下离心20min,收集细菌,然后用25mL的缓冲液I重悬,缓冲液I由20mM Tris·HCl、200mM NaCl、1mM DTT和pH7.5、1×蛋白酶抑制剂组成;将装有菌液的离心管在冰水的环境下进行超声波处理,每处理30s间歇

1min,直至菌体完全裂解;用20,000×g在4℃下离心30min,保留上清液,将上清液与1mL偶联有谷胱甘肽的树脂混合,在4℃下滚动结合2h,然后将该树脂装入层析柱,样品在层析柱下端流出后,用10mL PBS洗涤两次层析柱,用洗脱液洗脱10次,每次200μL,得到洗脱后的样品,洗脱液由20mM谷胱甘肽和50mM Tris·HCl组成,pH为9.0;将洗脱后的样品合并,分装后冻存于-80℃下。

7.根据权利要求4所述的YPB肽段的筛选及FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法,其特征在于步骤二中所述通过胺类偶合法将纯化后的His×6-YY1蛋白偶联到偶联用芯片上,然后在生物大分子互作仪上,利用该芯片分别测定纯化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白与偶联在芯片上的His×6-YY1蛋白的结合情况,得出GST-EZH2-Mut3能够与His×

6-YY1蛋白结合;进一步将GST-EZH2-Mut3平均分成GST-EZH2-Mut3a、GST-EZH2-Mut3b和GST-EZH2-Mut3c,然后在生物大分子互作仪上,利用所述芯片分别测定GST-EZH2-Mut3a、GST-EZH2-Mut3b和GST-EZH2-Mut3c与His×6-YY1蛋白的结合情况,得出GST-EZH2-Mut3b能够与His×6-YY1蛋白结合;再进一步将EZH2-Mut3b缩短为EZH2-Mut3b-S1和EZH2-Mut3b-S2,并分别表达GST-EZH2-Mut3b、GST-EZH2-Mut3b-S1和GST-EZH2-Mut3b-S2,然后经纯化后,与His×6-YY1蛋白进行体外蛋白结合,使用树脂拉下上述GST-融合蛋白,使用YY1抗体对拉下的样品进行检测,得出GST-EZH2-Mut3b-S1能够结合His×6-YY1,而GST-EZH2-Mut3b-S2不能结合His×6-YY1;再将GST-EZH2-Mut3b-S1和GST-EZH2-Mut3b-S2的序列进行对比,得到YPB肽段。

8.根据权利要求4所述的YPB肽段的筛选及FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法,其特征在于步骤二中所述纯化后的His×6-YY1蛋白与芯片偶联前,使用10mM、pH为4.5的NaOAc缓冲液进行稀释;步骤二中所述纯化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白进行测定前,使用10mM、pH为7.4的HEPES缓冲液进行稀释。

9.根据权利要求4所述的YPB肽段的筛选及FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法,其特征在于步骤二中所述利用偶联His×6-YY1蛋白的芯片分别测定纯化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白与His×6-YY1蛋白的结合能力,其结合时间为90s,解离时间为120s。

10.根据权利要求4所述的YPB肽段的筛选及FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法,其特征在于步骤二中所述的TAT的序列为Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R。