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专利号: 2020113448134
申请人: 湖南科技学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种转化酶C1‑2079在催化大豆苷元生成二氢大豆苷元中的应用,其特征在于所述应用为:以转化酶C1‑2079为催化剂,以大豆苷元为底物,以NADPH、NADH为辅酶,加入亚硫酸氢钠、二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟,以pH7.0的0.1M磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系,在37℃厌氧条件下反应2‑4h后,得到含有二氢大豆苷元的转化液;所述转化酶C1‑2079的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示;所述反应体系中,转化酶C1‑2079加入终浓度为40μg/ml,大豆苷元加入终浓度为20μg/ml,NADPH和NADH加入终浓度均为500μg/ml,亚硫酸氢钠加入终浓度为0.5mg/ml,二硫苏糖醇加入终浓度均为0.3mg/ml,苯甲基磺酰氟加入终浓度均为0.2mg/ml。

2.一种转化酶C1‑2079在催化二氢大豆苷元生成大豆苷元中的应用,其特征在于所述应用的方法为:以转化酶C1‑2079为催化剂,以二氢大豆苷元为底物,以pH 6.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系,在37℃条件下反应2‑4h后,得到含有大豆苷元的转化液;所述转化酶C1‑2079的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示;所述反应体系中,转化酶C1‑

2079加入终浓度为40μg/ml,二氢大豆苷元加入终浓度为20μg/ml。

3.一种转化酶C1‑2079在制备S‑雌马酚中的应用,其特征在于所述应用为:以含转化酶C1‑2079编码基因、二氢大豆苷元外消旋酶DDRC编码基因、二氢大豆苷元还原酶DHDR编码基因、四氢大豆苷元还原酶THDR编码基因的工程菌发酵培养液作为催化剂,以大豆苷元为底物,在37℃条件下静置发酵6‑8h,获得含S‑雌马酚的反应液,分离纯化,获得S‑雌马酚,所述转化酶C1‑2079的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述大豆苷元加入终浓度为40μg/ml;所述催化剂中菌体OD600为1.8。

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将包含转化酶C1‑2079编码基因、二氢大豆苷元外消旋酶DDRC编码基因、二氢大豆苷元还原酶DHDR编码基因、四氢大豆苷元还原酶THDR编码基因的工程菌接种至含有100μg/ml氨苄抗性和100μg/ml链霉素抗性的LB培养基中,37℃、180rpm孵育;当细菌OD600为0.6时,加入终浓度为0.2mM的IPTG,在16℃、120rpm条件下诱导表达16h,获得发酵培养液。

6.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述工程菌按如下方法构建:(1)转化酶C1‑

2079编码基因、载体PETDute‑1‑L‑DZNR‑DDRC分别经NotI和AvrII限制性内切酶酶切后连接,构建质粒PETDute‑1‑C1‑2079‑DDRC;(2)将PETDute‑1‑C1‑2079‑DDRC质粒加入到含0.1M氯化钙的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞液中,冰浴30min,然后42℃热冲击90s,再冰浴

2min,加入4倍体积的LB培养基,37℃,180rpm孵育1h;收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB平板中,37℃培养12‑16h;(3)挑取长出来的单菌落,在含有100μg/ml氨苄抗性的LB培养基中,37℃、180rpm培养2‑4h至细菌OD600为0.1;取菌液,在5000rpm条件下离心获得菌泥,将所获得的菌泥用无菌0.1M的CaCl2溶液洗涤三次,加入预冷的0.1M无菌CaCl2溶液悬浮菌体,然后在冰浴条件下孵育2‑4h;(4)将PCDFDute‑L‑DHDR‑THDR质粒加入到步骤(3)冰浴后的菌液中,将步骤(2)中氨苄抗性改为100μg/ml氨苄和100μg/ml链霉素抗性,其他操作同步骤(2),构建含PETDute‑1‑C1‑2079‑DDRC和PCDFDute‑L‑DHDR‑THDR的重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。