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专利号: 2020114040917
申请人: 江苏海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme,其特征在于:所述DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’‑3’)为:VV‑1:

TGGGGGCTGCTTGCAAAATCTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

2.根据权利要求1所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme,其特征在于:对核酸适配体进行突变或改造,使其能用于幽门螺旋杆菌的检测。

3.根据权利要求2所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme,其特征在于:DNAzymes 的序列的突变、改造包括:磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化;添加生物素、地高辛、荧光物质、淬灭集团、纳米材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。

4.据权利要求1或2所述的用于创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme,其特征在于:对所述的DNAzyme进行了碱基突变改造,得到3条具有活性的突变体DNAzymes,突变体DNAzyme核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列(5’‑3’)为:(1)VV‑M1:

TGGGGGCTGCTTGCAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT(2)VV‑M2:

TGGGGGCTGCTTGTAAAATTCGGTGCCACTGACGAATTTCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT(3)VV‑M3:

TGGGGGCTGCTTGTAATCGGTGCCACTGACGATCCCATGCTTCTGTTGACGACCACGATT。

5.一种创伤弧菌特异性识别RNA切割的DNAzyme的筛选方法,其特征在于:DNAzymes序列为权利要求1或4所述的序列,筛选步骤如下:(1) 合成含有35个随机碱基的寡核苷酸文库和含有切割位点及含有生物素标签的前后向引物;

(2) 将要检测的创伤弧菌在LB液体培养基中进行培养;

(3) 将步骤(2)所得创伤弧菌菌体进行离心,保留上清液;

(4) 将初始文库通过PCR反应进行连接,引入含有切割位点和生物素标签,醇沉法纯化回收;

(5) 将步骤(4)所得的PCR产物和链霉素包被的磁珠在37℃连接;

(6) 连接结束后磁性分离弃去上清液,磁珠用亲和素反应缓冲液进行清洗;

(7) 用0.2 mol的NaOH洗涤磁珠,磁性分离以制备单链;

(8) 用去离子水清洗磁珠使pH接近于中性;

(9) 将等体积的创伤弧菌胞外产物与2×筛选缓冲液混合均匀,37℃孵育切割1小时,磁性分离,醇沉法回收上清;

(10) PCR扩增步骤(9)醇沉后所得产物用于下一轮筛选;

(11) 高通量测序和DNA序列分析;

(12) 候选DNAzyme VV‑1活性及性质检测;

(13) DNAzyme碱基序列突变改造得到VV‑M1、VV‑M2和VV‑M3;

(14) DNAzyme切割速率测定。

6. 根据权利要求5所述的筛选方法,其特征在于:Biotin生物素标签均标记在DNA序列的5’端;所使用的创伤弧菌菌体浓度为2.2×109 CFU每毫升;所有的结合和切割反应均在

1.5毫升无菌无酶离心管中进行。

7.一种如权利要求1-4中所述的DNAzymesy的用途,其特征在于:该用途为于将DNAzymes用于创伤弧菌的特异性识别或检测。