1.一种基因工程菌,其特征在于,以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018为出发菌株,敲除了L‑色氨酸合成基因trp1和L‑苯丙氨酸合成基因pheA,并过表达
3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7,还融合表达了约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸解氨酶,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶和鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica)来源的NADPH黄素氧化还原酶;
所述酪氨酸解氨酶、4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶和NADPH黄素氧化还原酶之间均通过GSG串联;
所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述NADPH黄素氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述L‑色氨酸合成基因trp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;所述L‑苯丙氨酸合成基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸合成酶基因aro4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;所述双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
4.一种构建权利要求1 3任一所述基因工程菌的方法,其特征在于,将产甘油假丝酵母~
(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018的L‑色氨酸合成基因trp1和L‑苯丙氨酸合成基因pheA敲除,并过表达3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸合成酶基因aro4和双功能脉络膜酸合酶和黄素还原酶基因aro7,获得产甘油假丝酵母Cg‑1;
还将酪氨酸解氨酶基因、4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶基因和NADPH黄素氧化还原酶基因依次通过GSG串联连接至质粒pURGAPU的BamHI和NotI酶切位点之间,获得重组质粒,再将重组质粒线性化后转化至产甘油假丝酵母Cg‑1中;
所述酪氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述NADPH黄素氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求1 3任一所述的基因工程菌在生产咖啡酸或含咖啡酸的产品中的应用。
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6.一种生产咖啡酸的方法,其特征在于,将权利要求1 3任一所述的基因工程菌在以葡~
萄糖为碳源的培养基中发酵,所述发酵是在28 30℃有氧发酵至少48 h。
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