1.一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）海参体壁预处理：将新鲜海参解剖去除体腔内容物，洗净沥干水分，经匀浆机搅碎，得到海参泥；

步骤2）蛋白粗提取：将步骤（1）得到的海参泥与PBS缓冲液按1：3‑5 g/mL进行混合，0‑

10℃浸提12‑20 h，之后离心，离心后所得的蛋白上清液即为蛋白粗体液，此过程重复2‑3次，并合并上清液；

步骤3）三氯乙酸和丙酮混合沉淀：将步骤2）得到的混合上清液在50‑70℃下进行浓缩，浓缩至原体积的1/3‑1/5，将所得浓缩液边搅拌边加入三氯乙酸，使得三氯乙酸的终浓度为

10%‑15%，同时加入浓缩液1‑1.5倍体积的丙酮，搅拌均匀后，0‑10℃静置3‑5 h，离心后收集沉淀，此过程重复2 3次，合并沉淀物；

~

步骤4）用Sevage试剂除去非糖蛋白：将步骤3）得到的沉淀物复溶于8‑10倍体积的PBS缓冲液，调pH至7.2‑7.4，所得溶液采用Sevage试剂除去杂蛋白，得到海参体壁主要卵黄蛋白；

步骤5）将步骤4）得到的海参体壁主要卵黄蛋白边搅拌边加入硫酸铵沉淀目标蛋白，使得硫酸铵的终浓度为30%‑40%，4‑10℃条件下，磁力搅拌器中震荡30‑50 min，再经离心后，收集所得沉淀；

步骤6）透析除盐：在 步骤5）所得沉淀中加入3‑5倍体积的PBS缓冲液复溶，对盐溶液进行透析除盐，透析袋选用分子量为8000‑10000 Da，透析时间24‑36 h，即得主要卵黄蛋白溶液；

步骤7）冷冻干燥：将步骤6）中所得的主要卵黄蛋白溶液进行冷冻干燥，得到主要卵黄蛋白干粉；

所述Sevage试剂为氯仿和正丁醇体积比为5:1的混合试剂。

2.根据权利要求1所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤2）中所述PBS缓冲液的pH为7.0‑7.4、浓度0.01‑0.05mol/L。

3.根据权利要求1所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤3）中所述浓缩是真空旋转蒸发器中进行。

4.根据权利要求1所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤4）中所述PBS缓冲液的pH为7.0‑7.4、浓度0.01‑0.05 mol/L。

5.根据权利要求1所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤4）中调节pH用的是1‑1.5 M NaOH溶液。

6.根据权利要求1所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤5）中所述离心为低温离心，操作温度为4‑10℃，转速是3000‑4000r/min，时间是10‑

15 min。

7.根据权利要求1所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其特征在于，步骤6）中所述PBS缓冲液的pH为7.0‑7.4、浓度0.01‑0.05 mol/L。

8.根据权利要求1 7任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法，其~特征在于，步骤7）中冷冻干燥的操作参数：温度为‑83±1℃、时间为36‑48 h。

9.权利要求1 8任一所述的一种三步沉淀提取海参体壁主要卵黄蛋白的方法在海参体~壁主要卵黄蛋白提取中的应用。