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专利号: 2021100582958
申请人: 青岛科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种非诊断目的的检测肠道病毒CVB3的方法,包括如下步骤:

(1)复合材料ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs的制备

称取20mg的氮化硼粉末加入到盛有50.0mL的乙二醇溶液的烧杯中,超声剥离2h后使氮化硼均匀的分散在溶液中,制得BNNSs;之后将该装有BNNSs的烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌,同时用制备的5mM的氢氧化钠溶液滴定,直至溶液pH达到10.0;随后,将烧杯转移到恒温水浴加热搅拌器上,并向烧杯中加入2.0ml 0.0240mol/L氯金酸,在100℃恒温水浴中加热4h,加热完成后,将烧杯中的溶液分装到离心管中并分别离心三次,条件为12000r/min,

10min;离心后,收集沉淀物在80℃下干燥2h,获得了AuNPs/BNNSs材料;称取0.0150g AuNPs/BNNSs,分散于N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)中,将分散液置于4℃冰箱中待使用;称取

0.0150g块状硒化锌分散于N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)中,超声剥离8h后得到ZnSeNSs;最后,吸取2mL AuNPs/BNNSs和2mL ZnSeNSs分散液转移到同一离心管中,超声波振动使溶液均匀混合,制得ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs复合材料;

(2)CVB3含量的测定

首先,将碳粉和石蜡按3:1的比例混合在玛瑙研钵中,研磨均匀后,放入80℃的烘箱中,恒温加热30min,取出后研磨10min,再次放入烘箱中,重复此操作三次得糊状粉末;接下来,将糊状粉末放入玻璃管中,插入铜线,在抛光纸上抛光电极,用去离子水清洗电极,得到碳糊电极(CPE);再将1μL~50μL的ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs溶液滴到新制的碳糊电极表面上,并在空气中自然干燥;然后将1μL~50μL的1μM巯基化正向引物滴在电极表面,用pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤三次,去除多余的未结合引物;随后,将1μL~50μL的0.1mM巯基乙胺(MCH)滴在ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs修饰电极表面,封闭电极表面的非特异活性位点,并用氮气吹干电极;然后在ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上进行扩增;将2.4μL的10μM生物素标记的反向引物、

10μL模板溶液,29.5μL缓冲液和13.2μL去离子水混合并添加到RPA冻干酶颗粒体系中,然后再加入浓度为280mM的2.5μL醋酸镁溶液;之后取1μL~50μL滴加到ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上,在37℃下原位扩增30min后,电极用0.1M磷酸缓冲溶液洗涤;最后,将电极浸入2μL~

60μL链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(SA‑ALP)溶液中,在37℃下孵育30min,用0.1M磷酸缓冲溶液洗涤电极,将电极插入对氨基苯基磷酸单钠的溶液中,碱性磷酸酶(ALP)催化水解对氨基苯基磷酸单钠为对氨基苯酚;在对氨基苯酚的作用下产生强的光电信号,根据光电信号强度实现CVB3含量的测定;其所用的正向引物、反向引物序列如下:正向引物FP:5'‑SH‑AGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC‑3'

反向引物RP:5'‑Biotin‑GGATGGCCAATCCAATAGCTATATGGTAACAA‑3'。