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专利号: 2021100663936
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌,由如下方法构建:(1)以菌株E.coil CCTCC NO:M 20191026为底盘菌,在其基因组中的cysM基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM);

(2)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM)基因组中的NrdH基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH);

(3)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH)基因组中的cysW基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysW);

(4)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysW)基因组中的HflC基因和cysM基因铆钉连接,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysWHflC‑cysM);

(5)在质粒上过表达glpE基因,转化到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdHcysW HflC‑cysM)中得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysWHflC‑cysM)/p glpE)F,即为所述高产L‑半胱氨酸的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的工程菌,其特征在于所述基因工程菌为大肠杆菌ZJBSSC007(Escherichia coli ZJBSSC007),保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉武汉大学,邮编:430072,保藏日期:2020年12月3日,保藏编号:CCTCC NO:M 2020847。

3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法,包括如下步骤:(1)以菌株E.coilW3110 EYC为底盘菌,在其基因组中的cysM基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM);

(2)将工程菌E.coil CCTCC NO:M 20191026基因组中的NrdH基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH);

(3)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH)基因组中的cysW基因的启动子替换为trc启动子,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysW);

(4)将工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysW)基因组中的HflC基因和cysM基因铆钉连接,得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysWHflC‑cysM);

(5)在质粒上过表达glpE基因,转化到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdHcysW HflC‑cysM)中得到工程菌E.coil W3110 EYC(trc‑cysM NrdH cysWHflC‑cysM)/p glpE)F,即为所述高产L‑半胱氨酸的基因工程菌。

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.权利要求所述基因工程菌在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述应用为:将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基中,于25~30℃、180~200rpm条件下进行发酵培养,发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述L‑半胱氨酸。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述发酵培养基组成如下:葡萄糖40~45g/L、(NH4)2SO4 5~10g/L、KH2PO4 0.5~2.0g/L、Na2S2O3 5~10g/L、酵母提取物8g/L,Na2HPO4·

10H2O 1~5g/mL,0.5~2.0ml/L微量元素溶液,溶剂为去离子水,pH值自然;所述微量元素溶液组成如下:500g/L MgSO4·7H2O,5g/L FeSO4·7H2O,5g/L MnSO4·8H2O,5g/L ZnSO4,溶剂为去离子水。