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专利号: 2021101102572
申请人: 河南科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.OsPIN9突变基因在调控水稻抗冷胁迫中的应用,其特征在于:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的水稻OsPIN9基因,进而获得抗低温的水稻突变体;所述OsPIN9基因突变后编码区核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种提高水稻抗冷性的方法,其特征在于:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻OsPIN9基因的靶位点;所述OsPIN9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述靶位点的序列为:5’‑  TTCTCCAACGAGCAGTGCGC‑3’;编辑后的靶位点序列为:5’‑ TTCTCCAACGAGCAGTGTCGC‑3’。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:将所述水稻OsPIN9基因的靶位点连入CRISPR/Cas9表达载体CRISPR‑RICE,构建重组表达载体;通过农杆菌介导法将所述重组表达载体转化到受体植物材料中,获得抗冷性提高的基因编辑植株。

4.一种抗冷性水稻的培育方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤一、根据OsPIN9基因设计并得到靶位点序列,针对所述靶位点序列设计引物,将引物变性、退火后形成双链DNA,然后连接到经Bsa酶切后的CRISPR‑RICE载体,构建得到CRISPR/Cas9重组表达载体;所述OsPIN9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示,所述靶位点的核苷酸序列为5’‑ TTCTCCAACGAGCAGTGCGC‑3’;

步骤二、将步骤一所得CRISPR/Cas9重组表达载体转入农杆菌;

步骤三、通过农杆菌介导法将CRISPR/Cas9重组表达载体转入待基因编辑的受体水稻中,通过组织培养获得T0代阳性苗,通过PCR扩增获得含有靶位点的OsPIN9片段,测序确认获得OsPIN9突变体T0代植株;

步骤四、将步骤三所得T0代植株自交获得T1代植株,进一步通过PCR筛选获得OsPIN9突变的纯合 植株 ;纯合 突变体Os PIN9 基因的靶位 点序列突 变为 :5’‑ TTCTCCAACGAGCAGTGTCGC‑3’,突变后OsPIN9基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求4所述的培育方法,其特征在于:步骤一中,所述引物为:

PIN9‑crispr‑F: 5’‑TGTGTTTCTCCAACGAGCAGTGCGC‑3’,PIN9‑crispr‑R: 5’‑AAACGCGCACTGCTCGTTGGAGAAA‑3’。

6.根据权利要求4所述的培育方法,其特征在于:步骤三和步骤四中,所述PCR采用的引物为:PIN9‑assay‑F: 5’‑CGACCTGGCTTACGAACGAA‑3’,

PIN9‑assay‑R: 5’‑CCATGTCGAAGATGAGCACC‑3’。