1.OsPIN9突变基因在调控水稻抗冷胁迫中的应用,其特征在于:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的水稻OsPIN9基因,进而获得抗低温的水稻突变体;所述OsPIN9基因突变后编码区核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种提高水稻抗冷性的方法,其特征在于:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻OsPIN9基因的靶位点;所述OsPIN9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述靶位点的序列为:5’‑ TTCTCCAACGAGCAGTGCGC‑3’;编辑后的靶位点序列为:5’‑ TTCTCCAACGAGCAGTGTCGC‑3’。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:将所述水稻OsPIN9基因的靶位点连入CRISPR/Cas9表达载体CRISPR‑RICE,构建重组表达载体;通过农杆菌介导法将所述重组表达载体转化到受体植物材料中,获得抗冷性提高的基因编辑植株。
4.一种抗冷性水稻的培育方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一、根据OsPIN9基因设计并得到靶位点序列,针对所述靶位点序列设计引物,将引物变性、退火后形成双链DNA,然后连接到经Bsa酶切后的CRISPR‑RICE载体,构建得到CRISPR/Cas9重组表达载体;所述OsPIN9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示,所述靶位点的核苷酸序列为5’‑ TTCTCCAACGAGCAGTGCGC‑3’;
步骤二、将步骤一所得CRISPR/Cas9重组表达载体转入农杆菌;
步骤三、通过农杆菌介导法将CRISPR/Cas9重组表达载体转入待基因编辑的受体水稻中,通过组织培养获得T0代阳性苗,通过PCR扩增获得含有靶位点的OsPIN9片段,测序确认获得OsPIN9突变体T0代植株;
步骤四、将步骤三所得T0代植株自交获得T1代植株,进一步通过PCR筛选获得OsPIN9突变的纯合 植株 ;纯合 突变体Os PIN9 基因的靶位 点序列突 变为 :5’‑ TTCTCCAACGAGCAGTGTCGC‑3’,突变后OsPIN9基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求4所述的培育方法,其特征在于:步骤一中,所述引物为:
PIN9‑crispr‑F: 5’‑TGTGTTTCTCCAACGAGCAGTGCGC‑3’,PIN9‑crispr‑R: 5’‑AAACGCGCACTGCTCGTTGGAGAAA‑3’。
6.根据权利要求4所述的培育方法,其特征在于:步骤三和步骤四中,所述PCR采用的引物为:PIN9‑assay‑F: 5’‑CGACCTGGCTTACGAACGAA‑3’,
PIN9‑assay‑R: 5’‑CCATGTCGAAGATGAGCACC‑3’。