1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396‑P96作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域

465个核苷酸并在缺失位置插入一标记基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入另一标记基因，获得插入双基因标记的重组PRRSV病毒。

2.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法，其特征在于：将猪繁殖与呼吸综合征病毒传代致弱株GXNN1396‑P96Gxnn作为亲本毒株，利用基因工程的方法缺失NSP2区域465个核苷酸并在缺失位置插入红色荧光蛋白基因，在此基础上，在ORF1b和ORF2a间插入绿色荧光蛋白基因，获得插入双荧光蛋白基因标记的重组PRRSV病毒。

3.根据权利要求2所述的的构建方法，其特征在于：所述重组PRRSV病毒为rGX‑RFP‑GFP。

4.根据权利要求2所述的的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)表达红色荧光蛋白的PRRSV NSP2缺失突变体pGX‑NSP2‑RFP的构建在PRRSV感染性克隆中，采用SOE‑PCR方法缺失NSP2高变区第624位氨基酸‑778位氨基酸位点区域，同时在缺失区域引入了BstZ17I和SbfI两个酶切位点，先构建pGXAM的缺失突变体pGX‑NSP2‑D465，然后，插入红色荧光蛋白RFP基因，获得重组质粒pGX‑NSP2‑RFP。

(2)在PRRSV ORF1b和ORF2a间表达绿色荧光重组克隆pGX‑12BS‑GFP的构建。

在PRRSV感染性克隆中，利用SOE‑PCR方法在ORF1b和ORF2a间引入Bstb I和Sbf I两个限制性酶切位点，并将SOE‑PCR产物克隆到Zero PCR载体上，获得穿梭质粒pTOPO‑

12BS；利用突变PCR将转录调控序列TRS克隆到Sbf I酶切位点之后，获得pTOPO‑12BS‑TRS，通过将Asc I和Mlu I酶切pTOPO‑12BS‑TRS获得的相应片段克隆进入pGXAM，获得重组克隆pGX‑12BS‑TRS；在此基础上，通过人为引入的酶切位点Bstb I和Sbf I将GFP插入pGX‑12BS‑TRS中，获得重组质粒pGX‑12BS‑GFP。

(3)同时表达红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组质粒pGX‑RFP‑GFP的构建使用Asc I和Mlu I两个限制性酶切位点同时酶切pGX‑12BS‑GFP和pGX‑NSP2‑RFP，回收相应酶切产物后，通过T4酶进行连接，获得重组质粒pGX‑RFP‑GFP。

5.根据权利要求4所述的的构建方法，其特征在于步骤(1)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用JX451F和JX6463R扩增，PCR产物克隆到ZeroPCR载体，获得穿梭质粒pTOPO‑P2；以pTOPO‑P2为模板，使用突变引物NSP2 D155 BstZ17IF和NSP2 D155 SbfI R以及外侧引物GX2350F和GX3921R扩增得到PCR产物GF‑D155R‑BstZ17IF和D155F‑JR‑SbfI；以PCR产物GF‑D155R‑BstZ17IF和D155F‑JR‑SbfI为模板，使用外侧引物GX2350F和GX3921R进行第二轮融合PCR扩增，将PCR产物GF‑D155R‑BstZ17IF和D155F‑JR‑SbfI进行融合，将融合PCR产物和pTOPO‑P2同时使用Afe I和Bbs I限制性酶切位点进行酶切，T4连接后获得缺失155aa和引入Bstz 17I和Sbf I限制性酶切位点的克隆pTOPO‑P2‑D465，使用Spe Ⅰ和Afl II同时酶切pTOPO‑P2‑D465和pGXAM，进行相应区域的等段替换，获得pGX‑NSP2‑D465；在此基础上，使用引物RFP BstZ17I F和RFP SbfI R扩增红色荧光蛋白基因，使用BstZ17I和SbfI同时酶切pGX‑NSP2‑D465和PCR扩增产物，将RFP基因插入到pGX‑NSP2‑D465中，获得在NSP2缺失区域插入RFP基因的重组克隆pGX‑NSP2‑RFP。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤(2)具体按以下进行操作：以PRRSV的全长感染性克隆pGXAM为模板，使用突变引物12BS F和12BS R以及外侧引物GF11706和JX14402Mlu I扩增出包含有Bstb I和Sbf I限制性酶切位点的两段PCR产物，以两段PCR产物为模板，使用外侧引物GF11706和JX14402Mlu I进行第二轮融合PCR扩增，将融合PCR产物克隆到Zero PCR载体，获得穿梭质粒pTOPO‑12BS；以pTOPO‑12BS为模板，使用引物SbfI‑TRS‑F和JX14402MluI利用突变PCR获得含有TRS的PCR产物，将PCR产物和pTOPO‑12BS使用Sbf I和Mlu I同时酶切，T4连接后获得pTOPO‑12BS‑TRS；然后，使用Asc I和Mlu I同时酶切pTOPO‑12BS‑TRS和pGXAM，将含有酶切位点和TRS的酶切片段插入pGXAM中，获得重组质粒pGX‑12BS‑TRS；使用GFP基因的扩增引物GFP‑Bstb I‑F和GFP‑Sbf I‑R扩增GFP基因，然后使用Bstb I和Sbf I同时酶切PCR产物和pGX‑12BS‑TRS，将GFP基因插入pGX‑12BS‑TRS中，获得重组质粒pGX‑12BS‑GFP。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于步骤(3)具体按以下进行操作：使用Asc I和Mlu I两个限制性酶切位点同时酶切pGX‑12BS‑GFP和pGX‑NSP2‑RFP，进行对应区域的等段替换，获得重组质粒pGX‑RFP‑GFP。

8.权利要求2至7任一方法，其特征在于：所述病毒GXNN1396‑P96为保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒GXNN1396‑P96。

9.权利要求2至8任一方法所得的猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株。

10.权利要求8所述重组毒株在制备基因工程疫苗方面的应用。