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专利号: 2021102619463
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种纳米传感器在制备检测DNA羟化酶TET1活性的试剂盒中的应用,其特征是,一种检测DNA羟化酶TET1的试剂盒包括纳米传感器、尿苷二磷酸葡萄糖、缓冲溶液;所述检测DNA羟化酶TET1的纳米传感器包括发夹探针、T4噬菌体β‑葡萄糖基转移酶、内切酶、量子点;

所述发夹探针为能够形成茎环结构的单链DNA,所述发夹探针的一端连接荧光剂,另一端能够与量子点配合连接,形成茎环结构的茎区域含有被内切酶识别并剪切的位点,所述位点含有5‑甲基胞嘧啶;

量子点与荧光剂能够配合发生荧光共振能量转移;

所述荧光剂为Cy5,所述量子点为605QD;所述内切酶为内切酶MspI;

发夹探针通过生物素‑链霉亲和素与量子点连接;发夹探针连接生物素,量子点表面包被链霉亲和素;

发夹探针形成茎环结构后,能够连接量子点的一端突出;

发夹探针的序列为:

m m

TTT TTC ACT CCG GTC ACG TTT TCG TGA CCG GAG TG,其中,C为甲基胞嘧啶。

2.一种DNA羟化酶TET1活性的检测方法,其特征是,提供权利要求1所述的检测DNA羟化酶TET1的纳米传感器;步骤如下:TET1的测定:首先,检测探针与含有5mM MgCl2、10mM Tris‑HCl,且pH为8.0的缓冲液A在

95℃下孵育5min,缓慢冷却至室温;然后,在含有50mM HEPES、50mM NaCl、75μM Fe(NH4)2(SO4)2、2mM抗坏血酸、2.5mM DTT和1mMα‑KG的反应液中加入144nM检测探针和不同浓度的TET1,37℃反应30min;第三,反应产物与40μM尿苷二磷酸葡萄糖和3U T4噬菌体β‑葡萄糖基转移酶和含有50mM醋酸钾、20mM Tris‑Ac、10mM醋酸镁、1mM DTT,且pH为7.9的缓冲液B组成反应溶液,37℃孵育2h;随后,糖基化产物与30U MspI和含有10mM醋酸镁、20mM Tris‑Ac、

50mM醋酸钾、0.1mg/mL BSA,且pH为7.9的缓冲液C组成反应溶液,37℃消化2h;最后,将消化后的产物加入0.5nM 605QDs和含有100mM Tris‑HCl、10mM(NH4)2SO4、3mM MgCl2,且pH为8.0的60μl缓冲液D中,室温孵育20min,得到605QD‑DNA‑Cy5纳米结构;

m

TET1测定的检测探针为5’‑biotin‑TTT TTC ACT CCG GTC ACG TTT TCG TGA CCG GAG mTG‑Cy5‑3’,其中,C为甲基胞嘧啶;

凝胶电泳分析:MspI的消化产物与荧光指示剂混合加入12%的聚丙烯酰胺凝胶中,凝胶放入三羟甲基氨基甲烷‑硼酸中,在110V恒压室温条件下电泳40min;多通道成像由ChemiDoc MP成像系统完成。SYBR Gold信号使用460‑490nm激发的Epi‑blue和518‑546nm滤光片进行测量,Cy5信号使用625‑650nm激发的Epi‑red和675‑725nm滤光片进行测量;

荧光检测:荧光光谱由荧光分光光度计在488nm的激发波长下进行检测;

所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的。

3.一种权利要求1所述的试剂盒在筛选DNA羟化酶TET1药物中的应用,其特征是,所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

4.如权利要求3所述的应用,其特征是,所述DNA羟化酶TET1药物为TET1抑制剂。