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专利号: 2021103615864
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-03-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种一步法荧光检测体系,其特征是,包括,底物和模板:底物和模板均为单链DNA,底物含有8‑氧鸟嘌呤,底物的3’端用NH2修饰;模板由至少一条DNA1和至少一条DNA2交错连接形成,DNA1与DNA2中均不含腺嘌呤,DNA1与DNA2的连接处含有腺嘌呤脱氧核苷酸;底物与DNA1、一部分DNA2互补,与8‑氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1;

APE1酶:用于切割AP位点;

DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物:用于在切除AP位点后3’OH端进行延伸反应,dNTP中不含dTTP;

UDG酶:用于清除延伸反应获得延伸产物中的尿嘧啶;

荧光染料:用于与扩增产物产生荧光。

2.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系,其特征是,模板由两条DNA1和两条DNA2交错连接形成;

优选地,所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系,其特征是,所述DNA聚合酶为Klenow大片段聚合酶;

或,荧光染料为SYBR Green II。

4.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系,其特征是,底物的浓度为10nM时,模板的浓度为14~16nM;

‑4

或,底物的量为2×10 nmol时,APE1酶的用量为0.75~0.85U;

‑4

或,底物的量为2×10 nmol时,UDG酶的用量不低于2U,优选地,UDG酶的用量优选2.0~

2.2U;

‑4

或,底物的量为2×10 nmol时,Klenow大片段聚合酶的用量为1.9~2.1U;

或,底物的浓度为10nM时,dNTP/dUTP混合物的浓度为58~62μM。

5.一种DNA糖基化酶活性的检测方法,其特征是,将含有hOGG1的待测样品加入权利要求1~4任一所述的一步法荧光检测体系进行孵育,然后进行荧光检测。

6.如权利要求5所述的DNA糖基化酶活性的检测方法,其特征是,孵育温度为35~39℃;

或,孵育时间不低于40min;优选地,孵育时间为40~40.5min;

或,缓冲液为缓冲液A与缓冲液B的组合,所述缓冲液A包括浓度为18~22mM、pH为7.9~

8.1的Tris‑HCl,0.9~1.1mM的EDTA,0.9~1.1mM的DTT,0.09~0.11mg/ml的BSA;缓冲液B包括45~55mM醋酸钾,18~22mMTris‑acetate、9~11mM醋酸镁、0.9~1.1mM DTT;

或,荧光检测中,采用的激发波长为487~489纳米。

7.一种DNA糖基化酶活性的检测试剂盒,其特征是,包括权利要求1~4任一所述的一步法荧光检测体系、缓冲溶液。

8.一种权利要求1~4任一所述的一步法荧光检测体系在筛选hOGG1抑制剂中的应用。

9.一种权利要求1~4任一所述的一步法荧光检测体系在制备检测癌细胞试剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用,其特征是,所述癌细胞为A549细胞和/或HeLa细胞。