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专利号: 2021105585295
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.从微生物发酵液中分离纯化猪肌红蛋白的方法,其特征在于,利用如(a)~(c)任一所述方法从发酵液中分离纯化猪肌红蛋白;

(a)盐析‑脱盐‑阴离子交换法;

(b)盐析‑脱盐‑凝胶过滤层析法;

(c)浓缩‑阴离子交换法;

所述发酵液为利用表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母发酵得到的,所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母X33为宿主表达猪肌红蛋白;

所述发酵液的制备包括以下步骤:

(1)一级种子培养:将保存的所述重组毕赤酵母进行活化,在15~35℃,100~600rpm的条件下培养16‑18h;

(2)二级种子培养:将一级种子液以体积比1~5%的量接种到种子培养基中,在15~35℃,100~600rpm的条件下培养至OD600=6~8;

(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中,发酵罐培养,控制DO为20%~40%,搅拌转速200‑800rpm,通气量0.5~2.5VVM;

(4)发酵上清的制备:发酵至少84h后,取发酵液离心去除菌体,上清液采用真空抽滤,并进行收集得到发酵液。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述猪肌红蛋白通过添加硫酸铵进行浓缩。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,向发酵上清中缓慢加入硫酸铵粉末并搅拌至硫酸铵浓度达到50~60%饱和度,于1~4℃静置2h;4℃,5000~10000g离心25~35min收集上清;向上清中加入硫酸铵粉末,至硫酸铵浓度达到60~70%,于1~4℃静置过夜;5000~10000g离心25~35min收集沉淀;用10mM、pH 9.20的Tris‑HCl缓冲液将沉淀复溶得到浓缩液。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,当采用盐析‑脱盐‑阴离子交换法时,将得到的浓缩液上样到脱盐柱中,用10~15mM,pH 9.0~10.0的Tris‑HCl缓冲液进行平衡以及洗脱,并通过检测电导率,收集电导率变化前的洗脱峰,收集得到脱盐样品;将得到的脱盐样品上样到阴离子交换柱中,用10~15mM,pH9.0~10.0的Tris‑HCl缓冲液进行平衡,再用1~2MNaCl缓冲溶液进行梯度洗脱,并通过检测UV 280nm收集第二个洗脱峰,得到纯化后的猪肌红蛋白。

6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,当采用盐析‑脱盐‑凝胶过滤层析法时,将得到的浓缩液上样到脱盐柱中,用10~15mM,pH 9.0~10.0的Tris‑HCl缓冲液进行平衡以及洗脱,并通过检测电导率,收集电导率变化前的洗脱峰,收集得到脱盐样品;将得到的脱盐样品上样到凝胶过滤层析柱中,用10~15mM,pH 9.0~10.0的Tris‑HCl缓冲液进行平衡,再用10~15mM,pH 9.0~10.0的Tris‑HCl缓冲液进行洗脱,并通过检测UV280 nm收集洗脱峰,得到纯化后的猪肌红蛋白。

7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,当采用浓缩‑阴离子交换法时,将得到的浓缩液利用膜包进一步浓缩,将得到的浓缩上清上样到阴离子交换柱中,用10~15mM,pH9.0~10.0的Tris‑HCl缓冲液进行平衡,再用1~2M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱,收集洗脱浓度为20%NaCl的洗脱液,即为肌红蛋白纯品。

8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述膜包为:Vivaflow 200切向流过滤膜包。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,需用buffer B溶液进行洗脱,buffer B的盐度为10%~90%。

10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,利用膜包截取分子量大于10kDa的肌红蛋白。