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专利号: 2021105737194
申请人: 沈阳农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种鉴定山葡萄性别的分子标记,其特征在于,所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种鉴别山葡萄性别的方法,其特征在于,主要包括如下步骤:(1)提取山葡萄DNA;

(2)利用引物对对步骤(1)所提取的DNA进行PCR扩增;

(3)将步骤(2)所得的PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并拍照;

(4)根据步骤(3)所得的电泳图中的条带情况对山葡萄进行性别鉴定;

所述的引物对由如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异性引物组成,SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为:5’‑TTGCCAAGCCATTAAGAC‑3’;

SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为:5’‑GAAGAATGGGAAACAAGACA‑3’。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)的具体步骤包括:a)取山葡萄幼嫩叶片,研磨成粉末后,转入预热至50~70℃的溴化十六烷基三甲铵CTAB缓冲液中,50~70℃水浴提取10~200min,1000~20000rpm离心5~30min;

b)小心吸取步骤a)所得的上清液,加入等体积的氯仿和异戊醇混合液,其中氯仿和异戊醇体积比为24:1,涡旋混匀,5000~20000rpm离心5~30min,取上清液,加入2倍体积预冷至‑30~‑10℃的乙醇或异丙醇;

c)将步骤b)所得的溶液于5000~20000rpm离心5~30min,弃上清液;用体积分数为60~80%的乙醇清洗沉淀物2‑5次;晾干后,加入预热至55~75℃的ddH2O,即得到山葡萄基因组DNA;

d)利用1.0%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000分光光度计检测步骤c)所得的DNA样品的纯度和浓度,于‑20℃下保存。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述PCR扩增的程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸1min,重复循环32次,72℃延伸5min。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述PCR扩增的体系为:Taq DNA聚合酶10μL;5μM正向引物2μL;5μM反向引物2μL;模板DNA 1μL;加入ddH2O补齐到20μL。

6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中,所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤为:PCR扩增产物通过10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为220V、

400mA,电泳时间为90min。

8.权利要求1所述的分子标记或扩增权利要求1所述的分子标记的引物对在制备鉴定山葡萄性别的试剂或试剂盒中的用途;

扩增权利要求1所述的分子标记的引物对由如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异性引物组成,SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为:5’‑TTGCCAAGCCATTAAGAC‑3’;

SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为:5’‑GAAGAATGGGAAACAAGACA‑3’。