1.一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体,其特征在于:所述鲨鱼单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体,其特征在于:所述鲨鱼单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
3.一种如权利要求1或2的靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)分离免疫条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞,提取总RNA,再反转录为cDNA;
(2)以cDNA为模板,扩增条纹斑竹鲨vNAR片段,与载体连接构建噬菌体文库:采用巢式PCR,经过两轮PCR扩增,得到条纹斑竹鲨单域抗体vNAR基因;将vNAR基因片段与载体进行酶接后构建噬菌体文库;
(3)从噬菌体文库中淘选识别新冠病毒N蛋白的阳性克隆:通过对噬菌体文库进行扩大培养、富集、淘筛和鉴定,将所有OD450值大于1的阳性克隆进行测序分析,排除重复后,最终获得2株单域抗体,命名为鲨鱼单域抗体的N05抗体和N38抗体;通过测序,获得N05抗体和N38抗体的vNAR基因序列;
(4)构建表达载体,诱导表达新冠病毒N蛋白单域抗体:将N05抗体和N38抗体的vNAR基因序列克隆到PET30a上,获得N05抗体和N38抗体的表达载体,将表达载体转化至E.coliBL21菌株,扩大培养后,加入IPTG诱导表达,破菌收集纯化重组抗体蛋白。
4.如权利要求3所述的一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中免疫条纹斑竹鲨是在条纹斑竹鲨皮下注射重组新冠病毒N蛋白,剂量为
5nM/kg,间隔周期为14天,完成6次免疫的14天后获得重组新冠病毒N蛋白免疫的条纹斑竹鲨。
5.如权利要求3所述的一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中酶接过程首先用Sfi I分别对PCR得到的条纹斑竹鲨vNAR基因和pComb3XSS载体进行酶切,酶切回收后T4连接酶进行连接;将连接产物转化XL1‑Blue感受态细胞,培养至OD660达到0.6时,加入辅助噬菌体VCSM13,培养过夜后,收集培养基上清,获得初级噬菌体文库。
6.一种编码如权利要求1或2任一所述的鲨鱼单域抗体的核酸分子。
7.一种载体,其包含编码如权利要求1或2任一所述的鲨鱼单域抗体的核酸分子。
8.一种非诊断目的检测新冠病毒N蛋白的方法,其特征在于:包括以下步骤:S1、新冠病毒N蛋白假病毒感染HEK293T细胞;
S2、提取细胞总蛋白并将蛋白经过电泳、分离转运至PVDE膜上;
S3、在将经过亲和纯化的如权利要求1或2所述的鲨鱼单域抗体与PVDE膜接触,进行Western Blot检测。
9.一种如权利要求1或2任一所述的靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体在制备新冠抗体检测产品或药用组合物中的应用。