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专利号: 2021105983767
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166,已保藏于中国典型培养物保藏中心,地址中国武汉,武汉大学,分类命名为大肠杆菌YC166(Escherichia coli YC166),保藏日期2021年4月12日,保藏编号CCTCC NO:M2021358。

2.权利要求1所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程,其特征在于步骤如下:(1)自然界筛选:首先以大肠杆菌标准株K12为参照,选择菌落与K12菌株相近的菌落,测序后与MG1655基因序列比较,得到同源性高的197株菌株;

(2)高生物量宿主菌筛选:将步骤(1)所得197株大肠杆菌培养后制备为电转化感受态细胞,将重组质粒pKK223‑3‑ARO10*转入上述大肠杆菌感受态细胞中,筛选其中能够获得转化子的菌株,最终得到转入质粒pKK223‑3‑ARO10*后转化子具有产酪醇和高菌体浓度特点的宿主菌YEC039、YEC104和YEC166;

(3)宿主菌改造:对步骤(2)所得高浓度宿主菌YEC039、YEC104和YEC166进行产酪醇竞争途径基因feaB、pheA、tyrB和芳香族全局调控阻遏蛋白基因tyrR的敲除,最终得到能够完成敲除工作的宿主菌YEC166,完成上述基因敲除后得到的菌株为大肠杆菌YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB ΔtyrR;

(4)缩短发酵周期的产酪醇重组菌的获得:对步骤(3)获得的大肠杆菌YEC166 ΔfeaB ΔpheA ΔtyrB ΔtyrR再进一步转入控制酪醇合成的关键酶基因ARO10*表达的重组质粒pKK223‑3‑ARO10*,即获得缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166。

3.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程,其特征在于:步骤(1)中以大肠杆菌标准株K12为参照,选择菌落与K12菌株相近的菌落,得到800株菌株,全部进行

16s rDNA基因测序,将测序结果与大肠杆菌MG1655的基因组序列中的16s rDNA基因序列进行比较,以序列同源性为98.5%为标准用于下一步实验;最后获得197株菌株,编号为YEC001‑YEC197,全部保藏于江南大学中国高校工业微生物资源信息平台。

4.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程,其特征在于:步骤(2)中将在大肠杆菌中控制酪醇合成关键酶苯丙酮酸脱羧酶基因表达的重组质粒pKK223‑3‑ARO10*转入YEC001‑YEC197菌株培养后制备所得电转化感受态细胞中,用质粒pKK223‑3‑ARO10*电转化上述筛选获得的大肠杆菌的感受态细胞,获得转化子的是其中81株菌株;将上述81株转化子分别接种M9Y培养基,摇瓶发酵并间隔12小时检测菌体浓度,发酵至48小时检测酪醇产量,筛选出宿主菌编号为YEC039、YEC104和YEC166的三株宿主菌。

5.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程,其特征在于:步骤(3)中feaB基因的敲除中,采用的引物为PfeaB01、PfeaB02;PfeaB01序列如SEQ ID NO:1所示,PfeaB02序列如SEQ ID NO:2所示;

用于基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PfeaBU、PfeaBD和Pkan02;PfeaBU序列如SEQ ID NO:3所示,PfeaBD序列如SEQ ID NO:4所示,Pkan02序列如SEQ ID NO:5所示。

6.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程,其特征在于:步骤(3)中pheA基因敲除中,采用的引物为PpheA01、PpheA02;PpheA01序列如SEQ ID NO:6;PpheA02序列如SEQ ID NO:7所示;

用于pheA基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PpheAU、PpheAD;PpheAU序列如SEQ ID NO:8所示,PpheD序列如SEQ ID NO:9所示。

7.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程,其特征在于:步骤(3)中tyrB基因的敲除中,采用的引物为PtyrB01、PtyrB02;PtyrB01序列如SEQ ID NO:10所示,PtyrB02序列如SEQ ID NO:11所示;

用于tyrB基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PtyrBU、PtyrBD;PtyrBU序列如SEQ ID NO:12所示,PtyrBD序列如SEQ ID NO:13所示。

8.根据权利要求2所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的制备过程,其特征在于:步骤(3)中tyrR基因的敲除中,采用的引物为PtyrR01、PtyrR02;PtyrR01引物序列如SEQ ID NO:14;

PtyrR02引物序列如SEQ ID NO:15所示;

用于tyrR基因敲除重组菌鉴定的引物具体为PtyrRU、PtyrRD;PtyrRU序列如SEQ ID NO:16所示,PtyrRD序列如SEQ ID NO:17所示。

9.权利要求1所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的应用,其特征在于:将其应用于酪醇的摇瓶发酵或发酵罐发酵获取。

10.根据权利要求9所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的应用,其特征在于:采用产酪醇重组大肠杆菌YC166进行发酵,接种量为1%,培养基为M9Yb发酵培养基;30℃、200r/min发酵,发酵时间为24h。