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专利号: 2021106182319
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测犬IL‑6的ELISA试剂盒,其特征在于,所述ELISA试剂盒包括:pET‑IL6单克隆抗体、pET‑IL6多克隆抗体、酶标板、封闭液、羊抗兔酶标二抗、显色液、终止液;

其中,所述pET‑IL6单克隆抗体和pET‑IL6多克隆抗体是由pET‑IL6蛋白通过免疫动物制备的抗体,所述pET‑IL6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;

所述pET‑IL6单克隆抗体作为捕获抗体,pET‑IL6多克隆抗体作为检测抗体。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒,其特征在于,所述封闭液为2%~5%BSA、2%~

5%脱脂奶粉的一种或多种;其中百分数为质量比百分数。

3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒,其特征在于,所述pET‑IL6蛋白的制备方法为:扩增IL‑6基因,将IL‑6基因和载体pET‑32a(+)连接,得到pET‑IL6重组质粒;

将质粒转化到BL21大肠杆菌中,获得pET‑IL6重组菌;用0.1~1.5mmol/L IPTG对pET‑IL6重组菌进行诱导,22~42℃诱导培养2~6h,收集菌液,离心弃上清,沉淀后取上清,对所得蛋白洗涤溶解,进行纯化,即得pET‑IL6蛋白;

其中,所述IL‑6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述ELISA试剂盒,其特征在于,所述pET‑IL6单克隆抗体的浓度为24~48μg/mL,pET‑IL6多克隆抗体按1:500~1:100稀释。

5.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒,其特征在于,所述羊抗兔酶标二抗的稀释度为

1:1000~1:500。

6.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒,其特征在于,所述显色液为四甲基联苯胺。

7.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒,其特征在于,所述终止液为H2SO4。

8.权利要求1到权利要求7之一所述ELISA试剂盒,其特征在于,其使用方法包括以下步骤:S1.包被:pET‑IL6单克隆抗体,100μL/孔,加入酶标板内,将酶标板放入冰箱过夜;

S2.洗板:弃去S1中酶标板内液体,使用PBST进行洗板;

S3.封闭:在S2的酶标板中每孔加100μL的封闭液,于恒温箱37℃进行封闭,封闭后洗板步骤同S2;

S4.加样:在S3的酶标板中,每孔加入100μL样品,37℃条件下孵育,洗板步骤同S2;

S5.加检测抗体:将pET‑IL6多克隆抗体用封闭液稀释,在S4的酶标板中每孔加100μL稀释后的pET‑IL6多克隆抗体,于37℃条件下作用60min,洗板同S2;

S6.加二抗:向S5的酶标板中每孔加入稀释后的羊抗兔酶标二抗100μL,于37℃环境下孵育60min,洗板同S2;

S7.显色:避光环境下,向S6的酶标板中加显色液,100μL/孔,37℃条件下作用10min;

S8.终止:向S7的酶标板中每孔加入50μL终止液,终止反应;

S9.读数:使用酶标仪读取S8中酶标板每孔的OD450值。

9.根据权利要求8所述ELISA试剂盒,其特征在于,所述步骤S3中,封闭时间为1~2h。

10.根据权利要求8所述ELISA试剂盒,其特征在于,所述步骤S4中,样品的孵育时间为1~2h。