1.一种重组酯酶突变体,其特征在于所述重组酯酶突变体氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示。
2.一种权利要求1所述重组酯酶突变体编码基因,其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID No.2 所示。
3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组基因工程菌,其特征在于所述重组基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3) 为宿主菌。
4.一种权利要求1所述重组酯酶突变体在拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述应用是以含有重组酯酶突变体编码基因的工程菌经发酵诱导后得到的湿菌体、冻干菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂,以(R,S )‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯作为底物,在pH7.5、10‑200 mM 的PB缓冲液中,在反应条件为10‑40℃,200‑300rpm下进行反应,反应结束后,反应液分离纯化,得到(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述底物的加入终浓度以缓冲液体积计为1~
50g/L;催化剂的加入终浓度以缓冲液体积计为 0.0001 20g/L。
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7.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述湿菌体和冻干菌体按以下步骤获得:将含有重组酯酶突变体编码基因的工程菌接种至含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 液体培养基中,
37℃下培养 12‑16 h,获得种子液;按照体积浓度 1%的接种量将种子液转接到含 50 μg/ml 卡那霉素的 TB 液体培养基中,37℃振荡培养至OD600达到0.6‑0.8,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM,在18℃下诱导发酵 16‑18 h,发酵液经离心,取沉淀即为湿菌体;将湿菌体在‑20℃冷冻16小时,然后将冰冻好的湿菌体转移至冻干机,‑60℃、100Pa冻干24h,即为冻干菌体。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述纯酶按以下步骤获得:往每2g湿菌体加入
15 ml 4℃预冷的pH7.5、20mM 的PB缓冲液重悬细胞,200W超声破碎10 min,工作3 s,间隔3 s,将破碎液在4℃下12000 rpm离心10 min,取上清液通过Ni‑NTA亲和层析柱纯化,收集含有目的蛋白的洗脱液,并加入蔗糖作为保护剂,‑60℃、100Pa冻干24h后,即为重组酯酶突变体纯酶,所述蔗糖加入量以洗脱液体积计为50g/L。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述Ni‑NTA亲和层析柱纯化方法为:Ni‑NTA亲和层析柱用含有pH7.5、20mM咪唑的PB缓冲液平衡后,将粗酶液以流速2mL/min上样,上样结束后再用含有pH7.5、20mM咪唑的PB缓冲液洗平基线,最后用含pH7.5、200 mM咪唑的PB缓冲液以流速2mL/min洗脱目的蛋白,当UV280nm值大于200mAU时收集含有目的蛋白的洗脱液,当UV280nm值下降到小于200mAU停止收集。
10.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述反应液分离纯化方法为:反应结束后,往反应液中加入乙酸乙酯萃取反应液中的酯,然后离心分离水相和有机相,往水相中加入10M NaOH水溶液至pH 10.0,充分摇匀后离心取上清,往上清液中加6M HCl调节至pH 2.0 ,然后
0.01‑0.03MPa负压抽滤,滤渣,60℃干燥30min后为产物(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸。