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专利号: 202110755415X
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种重组酯酶突变体,其特征在于所述重组酯酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述重组酯酶突变体编码基因,其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组基因工程菌,其特征在于所述重组基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌。

4.一种权利要求1所述重组酯酶突变体在拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯中的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述应用是以含有重组酯酶突变体编码基因的工程菌经发酵诱导后得到的湿菌体、冻干菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂,以(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯作为底物,在pH7.5、10‑200mM的PB缓冲液中,在反应条件为

10‑40℃,200‑300rpm下进行反应,反应结束后,反应液分离纯化,得到(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述底物的加入终浓度以缓冲液体积计为1~

50g/L;催化剂的加入终浓度以缓冲液体积计为0.0001~20g/L。

7.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述湿菌体和冻干菌体按以下步骤获得:将含有重组酯酶突变体编码基因的工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中,37℃下培养12‑16h,获得种子液;按照体积浓度1%的接种量将种子液转接到含50μg/ml卡那霉素的TB液体培养基中,37℃振荡培养至OD600达到0.6‑0.8,加入诱导剂IPTG至终浓度为

0.2mM,在18℃下诱导发酵16‑18h,发酵液经离心,取沉淀即为湿菌体;将湿菌体在‑20℃冷冻16小时,然后将冰冻好的湿菌体转移至冻干机,‑60℃、100Pa冻干24h,即为冻干菌体。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述纯酶按以下步骤获得:往每2g湿菌体加入

15ml 4℃预冷的pH7.5、20mM的PB缓冲液重悬细胞,200W超声破碎10min,工作3s,间隔3s,将破碎液在4℃下12000rpm离心10min,取上清液通过Ni‑NTA亲和层析柱纯化,收集含有目的蛋白的洗脱液,并加入蔗糖作为保护剂,‑60℃、100Pa冻干24h后,即为重组酯酶突变体纯酶,所述蔗糖加入量以洗脱液体积计为50g/L。

9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述Ni‑NTA亲和层析柱纯化方法为:Ni‑NTA亲和层析柱用含有pH7.5、20mM咪唑的PB缓冲液平衡后,将粗酶液以流速2mL/min上样,上样结束后再用含有pH7.5、20mM咪唑的PB缓冲液洗平基线,最后用含pH7.5、200mM咪唑的PB缓冲液以流速2mL/min洗脱目的蛋白,当UV280nm值大于200mAU时收集含有目的蛋白的洗脱液,当UV280nm值下降到小于200mAU停止收集。

10.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述终产物分离纯化方法为:反应结束后,往反应液中加入乙酸乙酯萃取反应液中的酯,然后离心分离水相和有机相,往水相中加入10M NaOH水溶液至pH 10.0,充分摇匀后离心取上清,往上清液中加6M HCl调节至pH 2.0,然后

0.01‑0.03MPa负压抽滤,滤渣,60℃干燥30min后为产物(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸。