1.一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:克隆sgRNA表达框,所述sgRNA表达框依次连接有启动子和sgRNA支架,通过同源重组的方法把所述sgRNA表达框插入psgR‑Cas9‑At骨架载体,所述psgR‑Cas9‑At骨架载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、Cas9表达框,所述启动子为U6‑26或U3,所述U6‑26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,此步得到串联两个所述sgRNA表达框的中间载体;
S2:通过酶切连接的方法把所述sgRNA表达框和所述Cas9表达框插入pBI121骨架载体,得到pBI121‑Cas9;
S3:把步骤S2产物中所述sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点,得到pBI121‑MCS‑Cas9,所述MCS为多克隆位点;
S4:根据靶基因的DNA序列,设计2条sgRNA序列,分别为sgRNA1和sgRNA2,根据酶切位点的侧翼序列在所述sgRNA序列上加上接头作为PCR引物,所述PCR引物以步骤S1获得的所述中间载体为模板进行PCR扩增;
S5:通过同源重组的方法把步骤S4的PCR产物连入步骤S3的所述pBI121‑MCS‑Cas9中,获得所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S1中克隆sgRNA表达框使用的2对引物为:
2*U6‑26‑HR‑F1:ACGACGGCCAGTGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC;
2*U6‑26‑HR‑R1:CAAAAACTCCGAATGAAAAAAGCACCGACTCGGTG;
2*U6‑26‑HR‑F2:CCGAGTCGGTGCTTTTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC;
2*U6‑26‑HR‑R2:CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG;
所述psgR‑Cas9‑At骨架载体使用Sma I进行单酶切线性化。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S2中分别用Hind III和EcoR I双酶切所述psgR‑Cas9‑At骨架载体和所述pBI121骨架载体,酶切产物分别电泳后切胶回收,再用T4 DNA连接酶连接,得到所述pBI121‑Cas9。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S3中设计两对引物,以所述psgR‑Cas9‑At骨架载体为模板,分别克隆所述U6‑26启动子和所述sgRNA支架;Hind III和Sma I双酶切所述pBI121‑Cas9骨架载体,所述U6‑26启动子和所述sgRNA支架以及双酶切后的pBI121‑Cas9骨架载体同源重组,得到所述pBI121‑MCS‑Cas9;
步骤S3中使用的2对引物为:
Bpi‑MCS‑121HR‑F1:CATGATTACGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC;
Bpi‑MCS‑MR1:CTAAAACAAGCTTGTCGACCTCGAGCAATCACTACTTCGACTCTAGCTGTATATAA;
Bpi‑MCS‑MF2:GTGATTGCTCGAGGTCGACAAGCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA;
Bpi‑MCS‑121HR‑R2:CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG。
5.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S3中所述多克隆位点为Xho I‑Sal I‑Hind III。
6.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S5中使用Xho I和Hind III双酶切或者Xho I、Sal I、Hind III中任意一种单酶切所述pBI121‑MCS‑Cas9使之线性化。
7.一种用于构建植物双靶点CRISPR/Cas9载体的载体组合,其特征在于,所述载体组合由中间载体和pBI121‑MCS‑Cas9组成;所述中间载体以psgR‑Cas9‑At为骨架载体,所述psgR‑Cas9‑At骨架载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、Cas9表达框,所述中间载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、启动子、sgRNA支架、Cas9表达框;所述pBI121‑MCS‑Cas9以pBI121为骨架载体,所述pBI121‑MCS‑Cas9上依次连接有启动子、多克隆位点、sgRNA支架、Cas9表达框;所述多克隆位点为Xho I‑Sal I‑Hind III,所述启动子为U6‑26或U3,所述U6‑
26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.权利要求1所述的植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法在植物基因编辑中的应用,所述植物选自拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱中的任意一种。