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专利号: 2021109001781
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种醛酮还原酶KmAKR突变体,其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第164位、第182位、第232位或第266位进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述的醛酮还原酶KmAKR突变体,其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行下列之一突变:(1)第164位赖氨酸突变为谷氨酸;(2)第182位丝氨酸突变为组氨酸;(3)第232位丝氨酸突变为丙氨酸;(4)第266位谷氨酰胺突变为天冬氨酸;(5)第164位赖氨酸突变为谷氨酸,且第232位丝氨酸突变为丙氨酸;(6)第164位赖氨酸突变为谷氨酸,第232位丝氨酸突变为丙氨酸且第182位丝氨酸突变为组氨酸;(7)第164位赖氨酸突变为谷氨酸,第232位丝氨酸突变为丙氨酸,第182位丝氨酸突变为组氨酸且第266位谷氨酰胺突变为天冬氨酸。

3.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体编码基因构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体在不对称还原6‑氯‑(5S)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氯‑(3R,5S)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述应用为:将醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后的混合菌体作为催化剂,以6‑氯‑(5S)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯为底物,以葡萄糖为辅底物,以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系,在30~40℃、400~800rpm条件下进行反应,反应液分离纯化,获得6‑氯‑(3R,5S)‑二羟基己酸叔丁酯;所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌以SEQ ID NO.5所示葡萄糖脱氢酶基因转入宿主菌E.coli BL21(DE3)构建而成。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1~5:

1混合;所述转化体系中,底物加入终浓度30~400g/L,葡萄糖加入终浓度30~400g/L,催化剂加入量以混合菌体总干重计为0.1~20g DCW/L。

7.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体按如下方法制备:将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养10小时,以体积浓度1.0%的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、180rpm培养2h,再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷,28℃培养12h后,4℃、8000rpm离心

10min,获得含醛酮还原酶突变体基因的湿菌体。

8.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述催化剂为醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶。

9.如权利要求8所述的应用,其特征在于转化体系由催化剂、底物、NADPH和pH 7.0、

100mM的PBS缓冲液组成;所述转化体系中,纯酶加入量以蛋白含量计为0.01~1mg/mL,NADPH加入终浓度为0.5~5mM,底物加入终浓度为0.1~20mM。

10.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述纯酶按如下方法制备:(1)将醛酮还原酶KmAKR突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体按50g/L的量用pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液重悬,置于冰水混合物中,破碎10min;破碎条件:功率为350W,破碎1s,暂停1s,得到粗酶液;(2)将粗酶液经4℃、8000rpm条件下离心10min,去沉淀,上清液经0.22μm的滤膜过滤后,滤液作为上样液使用镍柱纯化酶蛋白,步骤为:先用超纯水冲洗管路中的杂质与空气,并除去镍柱中的20%无水乙醇;

平衡基线:用5~10倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱,使基线平衡;所述结合缓冲液为含0.3M的NaCl的20mM,pH 7.0的磷酸钠缓冲液;

样品上样:将滤液以0.25ml/min的流速上样;

洗脱杂蛋白:用5~10倍柱体积的冲洗缓冲液洗脱杂蛋白,流速1mL/min,直至基线平衡;所述冲洗缓冲液为含0.3M NaCl,20mM咪唑的20mM,pH 7.0的磷酸钠缓冲液;

洗脱目的蛋白:用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,流速为1mL/min;当紫外吸收检测值相对于基线向上扬起时收集流出液,当紫外吸收检测值回到基线时停止收集,将收集的目的蛋白置于冰上保存;所述洗脱缓冲液为含0.3M NaCl,500mM咪唑的20mM,pH 7.0的磷酸钠缓冲液;

透析:将收集的目的蛋白装入透析袋,置于pH 7.0、20mM的PBS溶液中,并放入4℃透析

12h,透析完成后截留液即为纯酶。