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专利号: 202111038703X
申请人: 东北林业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-08-21
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种红松胚性愈伤组织的遗传转化方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)红松胚性愈伤组织的继代培养:将红松胚性愈伤组织接种继代培养基中,在24 28~℃暗培养9 18天,即得遗传转化的受体;

~

(2)农杆菌侵染液的制备:将含有目的基因的农杆菌菌株转入乙酰丁香酮溶液中,重悬菌体至OD600=0.4~0.6,即得侵染液,备用;

(3)农杆菌介导的红松遗传转化和共培养:将遗传转化的受体浸泡在侵染液中侵染,沥干侵染液,然后接种至共培养培养基中,在23 27℃暗培养1 3d,即得共培养的胚性愈伤组~ ~织;

(4)抗性愈伤组织的筛选培养:将共培养的胚性愈伤组织转入到筛选培养基中培养10~

15d,连续筛选1 3次,获得抗性愈伤组织;

~

(5)抗性体胚培养:将抗性愈伤组织转入到体胚诱导培养基中,24 27℃黑暗培养40~ ~

60d,获得抗性体胚;

所述继代培养基由如下浓度的组分组成:0.1 0.5mg/L 2,4‑D、0.05 0.1mg/L 6‑BA、~ ~

340mg/L KNO3、400mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、370mg/L MgSO4·7H2O、3.1mg/L H3BO3、

4.3mg/L ZnSO4·7H2O、8.45mg/L MnSO4·H2O、0.125mg/L Na2MoO4·2H2O、0.415mg/L KI、

0.125mg/L CuSO4·5H2O、0.0125mg/L CoCl2·6H2O、0.0125mg/L NiCl2、13.9mg/L FeSO4·

7H2O、18.65mg/L Na2‑EDTA、278mg/L Ca(NO3)2·4H2O、42.5mg/L CaCl2·2H2O、1mg/L甘氨酸、 0.25mg/L Vitamin B5、0.25mg/L Vitamin B6、0.5mg/L Vitamin B1、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、4g/L结冷胶;所述继代培养基的pH为5.9;

所述共培养培养基为在所述继代培养基的基础上添加20 60μmol/L乙酰丁香酮;

~

所述体胚诱导培养基由如下浓度的组分组成:80μmol/L ABA、950mg/L KNO3、825mg/L NH4NO3、170mg/L KH2PO4、925mg/L MgSO4·7H2O、31mg/L H3BO3、43mg/L ZnSO4·7H2O、21mg/L MnSO4·2H2O、1.25mg/L Na2MoO4·2H2O、4.15mg/L KI、0.5mg/L CuSO4·5H2O、0.13mg/L CoCl2·6H2O、28mg/L FeSO4·7H2O、37mg/L Na2‑EDTA、11mg/L CaCl2·2H2O、0.5mg/L Vitamin B5、0.1mg/L Vitamin B6、0.1mg/L Vitamin B1、20g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L酸水解酪蛋白、12g/L结冷胶,2g/L活性炭;所述体胚诱导培养基的pH为5.8;

所述筛选培养基为在所述继代培养基的基础上添加10 50mg/L潮霉素、200mg/L头孢噻~肟钠。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法,其特征在于,所述步骤(4)之后,还包括抗性愈伤组织的鉴定:将抗性愈伤组织进行GUS染色和/或PCR检测,根据是否有蓝色显色反应和/或目的基因的条带,确定抗性愈伤组织中是否有GUS基因和/或目的基因的表达,若有GUS基因和/或目的基因的表达,表明红松遗传转化成功。

3.根据权利要求1所述的遗传转化方法,其特征在于,步骤(2)中,在转入乙酰丁香酮溶液前,还包括将含有目的基因的农杆菌菌株在固体培养基上培养,培养至对数期,收集菌体。

4.根据权利要求1所述的遗传转化方法,其特征在于,步骤(2)中,所述农杆菌为农杆菌GV3101,乙酰丁香酮溶液的浓度为20 60μmol/L。

~

5.根据权利要求3所述的遗传转化方法,其特征在于,所述固体培养基为在YEB固体培养基的基础上添加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。

6.根据权利要求5所述的遗传转化方法,其特征在于,所述YEB固体培养基由如下浓度的组分组成:5g/L牛肉膏、5g/L胰蛋白胨、1g/L酵母膏、4g/L MgSO4·7H2O、5g/L蔗糖、15g/L琼脂;所述YEB固体培养基pH为7.4。