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专利号: 2021111742965
申请人: 淮阴师范学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用,其特征在于:敲除水稻中OsFWL7基因以增加水稻籽粒金属微量元素含量,所述OsFWL7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述金属微量元素为Mn和Cu。

2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述敲除水稻中OsFWL7基因的具体方法为:利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻中的OsFWL7基因。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,具体步骤为:

1)在水稻OsFWL7基因的编码区选取靶标序列;

2)根据靶标序列合成带有粘性末端的接头引物,构建用于OsFWL7基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体;所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒;

3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中,利用农杆菌介导法转化常规水稻品种,获得转基因水稻植株;

4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定,从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定,获得纯合或双等位突变体;

5)对纯合突变体在T1代进行种植,利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测,即可获得无转基因插入、籽粒Mn和Cu含量显著增加的水稻。

4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤1)中,所述靶标序列有两个,其序列如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。

5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤2)中,所述具有所述靶标序列的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示;所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤5)中,用于HPT、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为:

HPTF:5’‑GGGTGTCACGTTGCAAGACC‑3’,HPTR:5’‑ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC‑3’,sgRNAF:5’‑TCCCAGTCACGACGTTGTAA‑3’,sgRNAR:5’‑GGCCATTTGTCTGCAGAAT‑3’,Cas9F:5’‑CACCATCTACCACCTGAGAA‑3’,Cas9R:5’‑CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG‑3’。