r

1.一种重组质粒pRed02‑Gm，其特征在于，核苷酸序列为如SEQ ID No.37所示序列。

2.一种对丁香假单胞菌进行基因敲除的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组质粒对丁香假单胞菌进行Psyr_1621基因全基因敲除，所述丁香假单胞菌为丁香假单胞菌丁香致病变种B728a(Pseudomonassyringaepv.syringaeB728a，PssB728a)；

所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组质粒通过电击转化导入所述丁香假单胞菌中，得到含有权r r利要求1所述的重组质粒pRed02‑Gm的重组子PssB728a/pRed02‑Gm；

(2)以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F1和R1，PCR扩增得到Psyr_1621基因的上游片段；

以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F2和R2，PCR扩增得到Psyr_1621基因的下游片段；

r

以pKD4质粒为模板，利用引物F3和R3，PCR扩增得到FRT‑Kan‑FRT片段；

r

将PCR扩增获得的Psyr_1621基因的上游和下游片段以及FRT‑Kan‑FRT片段共同作为模r板，通过重叠PCR方法，使Psyr_1621基因的上游片段、FRT‑Kan‑FRT片段和Psyr_1621基因r的下游片段搭桥成一个大片段；用Ω‑PCR的方法将所述大片段和pSRK‑Gm 质粒反应，转化后通过筛选和测序鉴定，获得用于Psyr_1621基因敲除的敲除盒片段克隆载体pSRK‑1621‑rKan；

r

所述pSRK‑1621‑Kan的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示；

所述F1的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述R1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述F2的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；所述R2的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

所述F3的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述R3的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

r

(3)以步骤(2)得到的pSRK‑1621‑Kan作为模板，分别以1621‑500F/R和1621‑250F/R作为引物，分别PCR扩增得到带有500bp和250bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物r电击转化至步骤(1)得到的PssB728a/pRed02‑Gm中，经过验证后得到Psyr_1621全基因敲除的丁香假单胞菌；

所述1621‑500F的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示；所述1621‑500R的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；

所述1621‑250F的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；所述1621‑250R的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示。

3.一种对丁香假单胞菌进行基因敲除的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组质粒对丁香假单胞菌进行Psyr_3467基因的N端600bp敲除，保留330bp；所述丁香假单胞菌为丁香假单胞菌丁香致病变种B728a(Pseudomonassyringaepv.syringaeB728a，PssB728a)；

所述方法包括以下步骤：

r

(1)将权利要求1所述的重组质粒pRed02‑Gm通过电击转化导入所述丁香假单胞菌中，r得到含有权利要求1所述的重组质粒的重组子PssB728a/pRed02‑Gm；

(2)以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F4和R4，PCR扩增得到Psyr_3467基因的上游片段；

以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F5和R5，PCR扩增得到Psyr_3467基因的下游片段；

将Psyr_3467基因的上游和下游片段进行酶切连接至pMD19‑T载体，得到重组质粒pMD19‑T‑3467‑up‑dn；

r r

以pHSG399‑FRT‑Kan ‑FRT质粒为模板，利用引物F6和R6，PCR扩增得到FRT‑Kan‑FRT片r段，再将所述FRT‑Kan ‑FRT片段与所述重组质粒pMD19‑T‑3467‑up‑dn酶切连接，再经转化r及菌落PCR筛选，获得用于Psyr_3467基因敲除的敲除盒片段克隆载体pMD19‑3467‑Kan；

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所述pMD19‑3467‑Kan的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示；

所述F4的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述R4的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；

所述F5的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；所述R5的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；

所述F6的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；所述R6的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；

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所述pHSG399‑FRT‑Kan‑FRT质粒是以pUC18‑Mini‑Tn7T‑Gm质粒为模板，FRTGmEcoRI Fr和FRTGmHindIIIR为引物，扩增得到FRT‑Gm‑FRTcassette片段，之后连接至pHSG399质粒构建得到；

所述FRTGmEcoRIF的核苷酸序列如SEQ ID No.42所示；所述FRTGmHindIIIR的核苷酸序列如SEQ ID No.43所示；

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(3)以步骤(2)得到的pMD19‑3467‑Kan 作为模板，利用引物3467‑750F/R，PCR扩增带有750bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物电击转化至步骤(1)得到的Pss B728a/rpRed02‑Gm中，经过验证后得到Psyr_3467部分基因敲除的丁香假单胞菌；

所述3467‑750F的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；所述3467‑750R的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示。