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专利号: 2021113743464
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种贻贝降血脂肽,其特征在于所述氨基酸系列为:Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe(YSGRGWIPF),ESI‑MS测定其分子量为1082.21 Da。

2.如权利要求1所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的制备,其包括以下步骤:

1)原料预处理:紫贻贝(Mytilusedulis)去壳和内脏、清洗、匀浆,加入乙酸乙酯,250 W超声脱脂25 min,过滤,重复3次上述操作,脱除脂质;干燥过滤所得固体物,研磨,得脱脂贻贝粉;

 2)贻贝虾粉的酶解:取脱脂贻贝粉,加入缓冲液,调节pH值至7.0,加入贻贝粉重量

2.5%中性蛋白酶,48℃酶解5小时,于沸水浴灭酶10 min,冷却至室温,后于12000 rmp离心

15 min,收集上清液,得酶解液(MNH);

3)贻贝寡肽的分离提取:将上述贻贝蛋白酶解液MNH利用截留分子量为3.0 kDa的超滤膜分级,收集超滤组分MNH‑I(分子量大于3.0 kDa)和MNH‑II(分子量小于3.0 kDa),测定超滤组分MNH‑I和MNH‑II对油酸(OA)诱导的HepG2细胞脂质堆积模型中脂质降低能力(用%空白组表示)(见表1),选择降脂能力最强的超滤组分MNH‑II依次经凝胶色谱分离和反相高效液相色谱分离纯化,得到多肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe。

3.根据权利要求2所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的制备,其特征在于所述步骤1)中的匀浆后的紫贻贝与乙酸乙酯的重量体积比为比1g:9 mL。

4.根据权利要求2所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的制备,其特征在于所述步骤2)中脱脂贻贝粉与缓冲液的重量体积比为1g:6 mL。

5.根据权利要求2所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的制备,其特征在于所述步骤2)中缓冲液为pH为7的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求2所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的5

制备,其特征在于所述的步骤2)中的中性蛋白酶的酶活力≥2.0×10 U/g。

7.根据权利要求2所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的制备,其特征在于所述步骤3)中的凝胶色谱分离步骤为:将MNH‑II溶于双蒸水配成浓度为40~50 mg/mL的溶液,经过0.45 μm微孔滤膜除去不溶物,加入到Sephadex LH‑20层析柱(2.5cm×160cm),用双蒸水进行洗脱,流速0.5‑0.8 mL/min,根据214 nm色谱图收集色谱峰MNH‑II‑1,MNH‑II‑2和MNH‑II‑3,测定各个色谱峰的降脂能力,活性最高色谱峰MNH‑II‑3为凝胶层析酶解物。

8.根据权利要求2所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的制备,其特征在于所述步骤3)中反相高效液相色谱分离纯化中的步骤为:将MNH‑II‑3用双蒸水配成25~30μg/mL的溶液,经过0.45μm微孔滤膜除去不溶物,加入到RP‑HPLC色谱柱进行纯化,根据214 nm色谱峰收集活性肽MNP‑1~MNP‑8,根据制备寡肽MNP‑1~MNP‑8的降血脂活性得1个高活性降脂肽MNP‑2,氨基酸序列测定为Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe (YSGRGWIPF),ESI‑MS测定分子量为1082.21 Da。

9.根据权利要求2所述一种贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe的制备,其特征在于所述步骤3)中反相高效液相色谱分离纯化RP‑HPLC的条件为:进样量15 μL;色谱柱Kromasil C‑18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:在0‑30 min内乙腈浓度从0匀速升至50%;紫外检测波长214 nm,洗脱速度0.8 mL/min。

10.如权利要求1所述贻贝降血脂肽Tyr‑Ser‑Gly‑Arg‑Gly‑Trp‑Ile‑Pro‑Phe在治疗或者辅助治疗高脂血症中的应用。