1.一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物,其特征在于:以乌苏里拟鲿和圆尾拟鲿的4个种间特异位点的核苷酸序列SEQ ID NO:1‑4为模板进行PCR引物设计,获得核苷酸序列为SEQ ID NO:5‑12的四对引物。
2. 根据权利要求1所述的用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物,其特征在于:核苷酸序列SEQ ID NO:5‑12为:SEQ5: 5'‑ CTCTTGCCTATATCGTGCCG ‑3'SEQ6: 5'‑ GTAATCATACTGCTTCTTGGGT ‑3'SEQ7: 5'‑ GTATTTATTGGAGGATGAGGA ‑3'SEQ8: 5'‑ GTTATGGAGTAGCACAGTCGT ‑3'SEQ9: 5'‑ TCCTACACTTTCATCTCCCAG ‑3'SEQ10: 5'‑ ACACTTCAACAGCCGCATC ‑3'SEQ11: 5'‑ GCTTTGCCGTTACGATACTT ‑3'SEQ12: 5'‑ TGCCTGAATCTGAACTGACTC ‑3'。
3.一种用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物试剂盒,其特征在于:所述引物试剂盒包含权利要求1或2所述的引物。
4.根据权利要求3所述的用于乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体鉴定的引物试剂盒,其特征在于:所述引物试剂盒还包括PCR技术常用的试剂Taq DNA 聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、重蒸水或MgCl2。
5.一种乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1. DNA抽提:抽提目标个体的基因组DNA;
S2. PCR 扩增:以S1抽提的目标个体的基因组DNA为模板,用权利要求1或2所述的四对引物对目标个体的基因组DNA分别进行PCR扩增,分别获得各目标个体四对引物的4个PCR扩增产物;
S3. 扩增产物电泳检测:将每个目标个体的4个PCR扩增产物等量混合,通过琼脂糖凝胶电泳并染色后检测S2获得的PCR扩增产物;
S4. 乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及其正反杂交个体鉴定:根据每个目标个体PCR扩增产物的带型鉴定其属于哪种鱼。
6.根据权利要求5所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法,其特征在于:所述S4中,具体的鉴定方法如下:仅在230 bp和133 bp处有条带的样本为乌苏里拟鲿;
在507 bp、419 bp、260 bp 和110 bp处均有条带的样本为圆尾拟鲿;
在507 bp和 419 bp处均无条带,在260 bp、230 bp、133 bp和110 bp至少三处有条带的为乌苏里拟鲿♀×圆尾拟鲿♂;
在507 bp和419 bp处均有条带,在260 bp、230 bp、133 bp和110 bp至少三处有条带的为圆尾拟鲿♀×乌苏里拟鲿♂。
7.根据权利要求5所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法,其特征在于:在所述S1中,采用苯酚‑氯仿DNA提取方法抽提目标个体尾鳍组织的基因组DNA。
8.根据权利要求5所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法,其特征在于:在所述S2中,PCR扩增的反应体系为:总体积25‑50 µL,包含80‑100 ng的模板DNA,
1.5 U Taq DNA聚合酶,2.5‑5 µL 10×PCR Buffer,0.8‑1.5 µL dNTP,SEQ5‑SEQ6、SEQ7‑SEQ8、SEQ9‑SEQ10、SEQ11‑SEQ12引物各0.8‑1.2 µL,灭菌超纯水18‑25 µL。
9.根据权利要求5所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法,其特征在于:在所述S2中,PCR扩增的程序为:95°C预变性6‑8分钟;95°C变性45‑60秒、50‑64°C退火45‑60秒、72°C延伸45‑60秒,30‑37个循环;最后72°C终延伸15‑20分钟,PCR扩增产物于4°C保存。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的乌苏里拟鲿、圆尾拟鲿及二者正反杂交个体的鉴定方法,其特征在于:所述S3中,扩增产物电泳检测的具体过程为:将PCR扩增产物等量混合后,在已加入GelGreen染色剂的2%‑5%琼脂糖凝胶中,300‑350 V电压下电泳2‑3分钟,然后在200‑240 V恒定电压下电泳15‑25分钟进行分离。