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专利号: 2021116695072
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种重组杆状病毒,其特征在于,所述重组杆状病毒含有细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3的编码序列,可同时表达iap1、iap2和iap3;优选地,所述重组杆状病毒含有如SEQ ID NO:9‑SEQ ID NO:11所示的序列。

2.一种如权利要求1所述重组杆状病毒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:

(1)以野生型BsNPV病毒基因组为模板,基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3;

(2)将步骤(1)获得的细胞凋亡调控因子iap1、iap2、iap3和egfp共同连接到原始质粒pFBDM上,获得可同时表达iap1、iap2、iap3和egfp的重组质粒pFBDM‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp;

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pFBDM‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp转至E.coli Sw106菌株,完成Tn7转座和基因重组,构建出E.coli Sw106 Bacmid‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp;

(4)将步骤(3)获得的E.coli Sw106 Bacmid‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp侵染昆虫sf9细胞,生产得到重组杆状病毒AcMNPV‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp。

3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中扩增iap1的引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物;所述步骤(1)中扩增iap2的引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物;所述步骤(1)中扩增iap3的引物包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物。

4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中重组质粒pFBDM‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp含有如SEQ ID NO:9‑SEQ ID NO:12所示的序列。

5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中基因扩增获得细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3:

以野生型BsNPV病毒基因组为模板,使用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物扩增获得基因片段iap1,在基因片段iap1上下游分别引入了限制性内切酶位点,其中上游为BamH I,下游为Sal I;

以野生型BsNPV病毒基因组为模板,使用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物扩增获得基因片段iap2,在基因片段iap2上下游分别引入了限制性内切酶位点,其中上游为Xma I,下游为Xho I;

以野生型BsNPV病毒基因组为模板,使用如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物扩增获得基因片段iap3,在基因片段iap3上下游分别引入了限制性内切酶位点,其中上游为BamH I,下游为Sal I;

所述步骤(2)中egfp是以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)基因为模板,使用如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物扩增获得的,在egfp上下游分别引入了限制性内切酶位点,其中上游为Xma I,下游为Xho I。

6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中重组质粒pFBDM‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp的构建方法具体包括:利用BamH I和Sal I酶切位点,将iap1连接到原始质粒pFBDM上,获得pFBDM‑iap1;利用Xma I和Xho I酶切位点,将iap2连接到pFBDM‑iap1上,获得pFBDM‑iap1‑iap2;

利用BamH I和Sal I酶切位点,将iap3连接到另一原始质粒pFBDM,获得pFBDM‑iap3;利用Xma I和Xho I酶切位点,将egfp连接到pFBDM‑iap3上,获得pFBDM‑iap3‑egfp;

使用Pme I和Avr II内切酶处理pFBDM‑iap1‑iap2,获得基因片段polh‑iap1‑polyA‑p10‑iap2‑polyA;同时利用BstZ171和Spe I内切酶处理pFBDM‑iap3‑egfp,分别利用同尾酶Pme I/BstZ171和Avr II/Spe I,将polh‑iap1‑polyA‑p10‑iap2‑polyA片段连入质粒pFBDM‑iap3‑egfp,获得重组质粒pFBDM‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp。

7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中E.coli Sw106 Bacmid‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp的构建方法具体包括:将E.coli Sw106活化后,接种到液体LB培养基内,加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素、终浓度为5μg/mL的壮观霉素、终浓度为5μg/mL的四环素、终浓度为5μg/mL的二氨基庚二酸,

32℃,180rpm震荡培养细菌至OD600=0.5;4℃,3000g离心去上清,加入终浓度为0.1M的CaCl2溶液,4℃静止30分钟;重复上述离心、静置步骤一次,制备100uL的感受态细胞E.coli Sw106;加入5ug步骤(2)获得的重组质粒pFBDM‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp和800uL液体LB培养基,32℃、150rpm震荡培养过夜完成Tn7转座和基因重组;取完成Tn7转座和基因重组的重组菌液50‑80uL,均匀涂于含有Kan、Spe、Tet抗生素、DAP、IPTG和X‑gal的LB固体培养基平板上,32℃倒置培养36‑48h;挑取上述LB固体培养基的蓝色单克隆菌落,使用iap1、iap2、iap3和egfp基因的引物,进行菌落PCR鉴定,获得E.coli Sw106 Bacmid‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp。

所述步骤(4)具体包括:取步骤(3)获得的E.coli Sw106 Bacmid‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp菌液,4℃、3000g离心弃上清,使用无菌水清洗沉淀3次,彻底除去培养基中DAP,沉淀用

0 ‑1 ‑2

1mL的Grace基础培养基重悬,标记为10 ,并使用Grace基础培养基依次稀释出10 、10 、10‑3

浓度的菌液;将sf9细胞均匀地铺于24孔细胞皿,待细胞密度为90%,用无抗生素和无血清的Grace培养基清洗细胞2次,按照500uL/孔的量,分别加入不同浓度的E.coli Sw106 Bacmid‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp,28℃静置培养4小时,弃上清,无抗生素和无血清的Grace培养基清洗细胞2次,每孔加入500uL的Grace完全培养基,28℃培养72小时;期间使用荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的产生情况;待绿色荧光达到最大值后,收集细胞上清,再次感染正常的sf9细胞。反复完成上述病毒感染2‑3次,获得重组杆状病毒AcMNPV‑iap1‑iap2‑iap3‑egfp。

8.一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的组合物,其特征在于,所述组合物包括细胞凋亡调控因子iap1、iap2和iap3。

9.如权利要求1所述的重组杆状病毒或者如权利要求8所述的组合物在制备降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡或者降低子代病毒的增殖速率的产品中的应用。

10.一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法,其特征在于,所述方法包括采用如权利求1所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞。