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专利号: 2022102796852
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种溶葡萄球菌酶编码基因Opt‑Lys的核苷酸序列,如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体,包含权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt‑Lys的核苷酸序列,如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组菌,包含权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt‑Lys的核苷酸序列,如SEQ ID NO.1所示;

优选的,所述重组菌为大肠杆菌重组菌。

4.一种大肠杆菌重组菌的构建方法,包括如下步骤:

(1)PCR扩增权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt‑Lys,PCR引物为Opt‑Lys‑F,如SEQ ID NO.2所示与Opt‑Lys‑R,如SEQ ID NO.3所示;

扩增产物纯化后,获得包含pET22b载体同源臂以及基因Opt‑Lys的扩增片段;将该片段连接到经NdeI与XhoI双酶切处理后的pET22b(+)载体片段,构建重组质粒,命名为pET22b(+)‑Opt‑Lys;

(3)将重组质粒pET22b(+)‑Opt‑Lys转化至大肠杆菌BL21(DE3),挑选阳性克隆获得大肠杆菌重组菌,命名为BL21(DE3)/pET22b(+)‑Opt‑Lys。

5.如权利要求4所述构建方法,其特征在于,步骤(1)中使用同源重组法将扩增片段连接至pET22b(+)载体片段,连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布至含有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB平板,36‑37℃培养12‑16h,挑取转化子于含有氨苄青霉素的LB培养基,于

36‑37℃、180‑200rpm培养12‑16h,然后提取质粒,使用引物Opt‑Lys‑F与Opt‑Lys‑R进行质粒PCR验证后,得到重组质粒,命名为pET22b(+)‑Opt‑Lys。

6.如权利要求4所述构建方法,其特征在于,步骤(1)中,PCR扩增条件:2×Taq Master Mix25μL,10μM的上下游引物各2μL,DNA模板1μL,add ddH2O至50μL;

PCR反应条件:95℃预变性5min;95℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环,

72℃延伸10min,4℃保存。

7.如权利要求4所述构建方法,其特征在于,步骤(2)中将重组质粒pET22b(+)‑Opt‑Lys通过热激法至大肠杆菌BL21(DE3)中,涂布至含有氨苄青霉素抗性的LB平板,36‑37℃培养

12‑16h,挑取菌落获得大肠杆菌重组菌,命名为BL21(DE3)/pET22b(+)‑Opt‑lys。

8.权利要求4‑7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌在产溶葡萄球菌酶中的应用。

9.权利要求4‑7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌产溶葡萄球菌酶的方法,其特征在于,包括如下步骤:将大肠杆菌重组菌接至含有氨苄青霉素以及终浓度为48‑51mM甘氨酸的LB培养基中,培养到OD600nm至0.25‑0.35后,添加终浓度为0.8‑1.1g/L的乳糖,并在36‑37℃、180‑200rpm培养35‑37h,固体分离,取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液。

10.如权利要求9所述方法,其特征在于,所述方法,包括如下步骤:

将大肠杆菌重组菌培养于含有氨苄青霉素的LB培养基,37℃200rpm培养12h获得种子液,将种子液以体积分数2%的比例转接至含有氨苄青霉素以及50mM甘氨酸的LB培养基中,培养到OD600nm至0.3后,添加终浓度为1g/L的乳糖,并在37℃下诱导培养36h,固体分离,取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液;

所述方法中,氨苄青霉素在培养基中的终浓度为100μg/mL。