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专利号: 2022103993805
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种突变果胶裂解酶pelF‑th,其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种突变果胶裂解酶pelF‑th,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.一种重组载体,其特征在于,包含权利要求1所述突变果胶裂解酶pelF‑th。

4.一种重组菌,其特征在于,包含权利要求1所述突变果胶裂解酶pelF‑th。

5.一种含突变果胶裂解酶pelF‑th基因的大肠杆菌工程菌的构建方法,包括如下步骤:(1)以pET‑28a(+)‑pelF基因为模板,通过反向PCR扩增pET‑28a(+)‑pelF‑th基因,pelF‑th的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,获得重组质粒pET‑28a(+)‑pelF‑th;

(2)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将步骤(1)制得的重组质粒pET‑28a(+)‑pelF‑th转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆,得到含突变果胶裂解酶pelF‑th基因的大肠杆菌工程菌。

6.如权利要求5所述方法,其特征在于,所述步骤(1)中,以pET‑28a(+)‑pelF基因片段为模板进行反向PCR扩增,扩增引物F1的核苷酸序列为SEQIDNO.5,扩增引物R1的核苷酸序列为SEQIDNO.6。

7.如权利要求6所述方法,其特征在于,所述步骤(1)中,PCR扩增的反应体系如下,总体系为50μl:PCR扩增程序如下:

95℃预变性3min;94℃变性15sec,60℃退火15sec,72℃延伸3min15sec,30个循环;72℃延伸5min,4℃保存。

8.如权利要求5所述方法,其特征在于,所述步骤(2)中,筛选阳性克隆的方法为,将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上,37℃培养,挑取单菌落接种至含有

50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养,然后通过PCR验证,得到目的基因条带的阳性克隆子,测序后,保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。

9.权利要求4所述重组菌或权利要求5所述的方法制得的大肠杆菌工程菌在生产果胶裂解酶中的应用。