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专利号: 2022105718323
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组菌株,其特征在于,以大肠杆菌为宿主,进行了如下至少一种改进:

(1)过表达甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC,磷酸甘露糖变位酶ManB,GDP‑甘露糖‑

4,6‑脱水酶Gmd,GDP‑岩藻糖合成酶WcaG,DNA结合转录激活因子RcsA和RcsB,2’‑岩藻糖基乳糖合成酶FutC,β‑半乳糖苷透性酶LacY,糖外排转运蛋白SetA,鸟苷激酶Gsk和NADP(+)‑依赖性葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶zwf;

(2)敲除GDP‑甘露糖甘露糖水解酶NudD,β‑半乳糖苷酶LacZ,GDP‑甘露糖水解酶NudK,十一磷酸葡萄糖‑1‑磷酸转移酶WcaJ,L‑岩藻糖异构酶FucI,L‑岩藻糖激酶FucK,HslVU蛋白酶的ATPase成分ClpY,HslVU蛋白酶的肽酶成分ClpQ,Lon蛋白酶Lon,L‑鼠李糖异构酶RhaA,L‑阿拉伯糖异构酶AraA。

2.根据权利要求1所述的重组菌株,其特征在于,所述宿主为大肠杆菌BL21 star(DE3)、大肠杆菌K12 MG1655或大肠杆菌JM109。

3.根据权利要求1或2所述的重组菌株,其特征在于,所述过表达是将基因在质粒上多拷贝表达。

4.根据权利要求3所述的重组菌株,其特征在于,所述质粒是pRSF‑Duet‑1、pET‑Duet‑1或pCDF‑Duet‑1。

5.根据权利要求1或2所述的重组菌株,其特征在于,所述基因工程菌利用pRSF‑Duet‑1质粒表达基因ManC、ManB、Gmd和WcaG;和/或利用pET‑Duet‑1质粒表达基因RcsA、RcsB和FutC;和/或

利用pCDF‑Duet‑1质粒表达基因LacY、SetA、Gsk和Zwf。

6.根据权利要求5所述的重组菌株,其特征在于,所述DNA结合转录激活因子RcsA和RcsB的N端融合硫氧还蛋白A;所述2’‑岩藻糖基乳糖合成酶FutC的N端融合类泛素蛋白修饰分子SUMO。

7.一种提高大肠杆菌2’‑岩藻糖基乳糖产量的方法,其特征在于,利用多拷贝质粒过表达甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC、磷酸甘露糖变位酶ManB、GDP‑甘露糖‑4,6‑脱水酶Gmd、GDP‑岩藻糖合成酶WcaG、DNA结合转录激活因子RcsA和RcsB、带有N端融合蛋白标签2’‑岩藻糖基乳糖合成酶FutC、β‑半乳糖苷透性酶LacY、糖外排转运蛋白SetA、鸟苷激酶Gsk和NADP(+)‑依赖性葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶zwf,并利用pTargetF质粒敲除GDP‑甘露糖甘露糖水解酶基因NudD、GDP‑甘露糖水解酶基因NudK、β‑半乳糖苷酶基因LacZ、十一磷酸葡萄糖‑1‑磷酸转移酶基因WcaJ、L‑岩藻糖异构酶基因FucI、L‑岩藻糖激酶基因FucK、HslVU蛋白酶基因的ATPase成分ClpY、HslVU蛋白酶基因的肽酶成分ClpQ、Lon蛋白酶基因Lon、L‑鼠李糖异构酶基因RhaA、L‑阿拉伯糖异构酶基因AraA中的一个或多个基因。

8.一种生产2'‑岩藻糖基乳糖的方法,其特征在于,以甘油为碳源,以乳糖为底物,利用权利要求1~6任一所述的重组菌株在25~37℃发酵生产2'‑岩藻糖基乳糖。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,发酵至初始碳源消耗完后流加甘油,至初始乳糖消耗完后流加乳糖并维持乳糖浓度为3~10g/L。

10.权利要求1~6任一所述的重组菌株或权利要求7~9任一所述的方法在生产2'‑岩藻糖基乳糖或含有2'‑岩藻糖基乳糖的产品中的应用。