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专利号: 202211159069X
申请人: 苏州卫生职业技术学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 染料;涂料;抛光剂;天然树脂;黏合剂;其他类目不包含的组合物;其他类目不包含的材料的应用
更新日期:2025-03-30
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:1)采用包含氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉和4‑巯基苯硼酸在内的原料,通过水热法合成碳量子点;2)制备比率型荧光碳点配合物:2‑1)利用步骤1)得到的碳量子点制备碳点溶液;2‑2)将稀土金属离子Mn+的溶液与碳点溶液混合,用碱溶液调节反应体系的pH值至7‑10,在加热下反应,制备得到M与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物;3)制备羧基聚苯乙烯微球;4)将步骤2)得到的比率型荧光碳点配合物修饰到步骤3)得到的羧基聚苯乙烯微球上,得到该比率型荧光探针。2.根据权利要求1所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,其中,Mn+为Tb3+、Eu3+、DY3+或Sm3+。3.根据权利要求2所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤1)具体包括:1‑1)将氨水杨酸、5,10,15,20–四(4–羟基苯基)卟啉、4‑巯基苯硼酸加入乙醇和水的混合溶液中,超声,得到混合物;1‑2)将步骤1‑1)得到的混合物转移到水热反应釜中,150‑230℃下反应8‑24h;1‑3)反应结束后冷却至室温,产物离心,离心液先用滤膜过滤,得到的滤液用截留分子量为500‑1000Da的透析袋透析12‑48h,收集透析袋内的透析液,冷冻干燥,得到碳量子点。4.根据权利要求3所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤2)具体包括:2‑1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5‑30min,制备得到碳点溶液;2‑2)制备稀土金属离子Mn+的溶液,然后在持续搅拌下将Mn+溶液加入到步骤2‑1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7‑10,在50‑85℃,反应10‑60min;2‑3)反应结束后冷却至室温,产物在2000‑6000rpm下离心1‑5min,固体产物真空干燥,得到M与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。5.根据权利要求4所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,其中,Mn+为Tb3+,所述步骤2)具体包括:2‑1)将步骤1)制备的碳点加入超纯水中,搅拌,超声分散5‑30min,制备得到碳点溶液;2‑2)将Tb(NO3)3·6H2O溶解在超纯水中,制备得到Tb3+溶液,然后在持续搅拌下将Tb3+溶液加入到步骤2‑1)得到的碳点溶液中,用碱溶液调节反应体系的pH值至7‑9,在55‑70℃,反应10‑60min;2‑3)反应结束后冷却至室温,产物在2000‑6000rpm下离心1‑5min,固体产物真空干燥,得到Tb与碳量子点的配合物,即所述比率型荧光碳点配合物。6.根据权利要求5所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,其中,所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氨水。7.根据权利要求1所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤3)具体包括:

3‑1)制备聚苯乙烯微球:3‑1‑1)将PVP溶解于无水乙醇中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物A;3‑1‑2)将AIBN加入苯乙烯中,搅拌均匀,通入N2,得到混合物B;3‑1‑3)将混合物A和B混合,搅拌均匀,于40‑65℃下反应5‑45min,然后升高温度至68‑95℃,聚合反应6‑24h;3‑1‑4)反应结束后离心,将离心得到的固体产物用乙醇和去离子水依次清洗,干燥过夜,得到聚苯乙烯微球;3‑2)聚苯乙烯微球表面羧基化包覆:3‑2‑1)将聚苯乙烯微球分散在十二烷基硫酸钠溶液中;3‑2‑2)向步骤3‑2‑1)得到的混合物中加入过硫酸钠、十一烯酸的乙醇溶液和二乙烯基苯的甲醇溶液,搅拌均匀,超声3‑25min;3‑2‑3)于55‑90℃下反应3‑10h,反应结束后离心,离心得到的固体产物用乙醇和水依次清洗,干燥,得到羧基聚乙烯微球。8.根据权利要求7所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤4)具体包括:4‑1)将步骤2)制得的比率型荧光碳点配合物加入去离子水中,超声分散,制备成荧光碳点配合物溶液;4‑2)向荧光碳点配合物溶液中加入1,3‑二环己基碳二亚胺;4‑3)取步骤3)制得的羧基聚乙烯微球加入到步骤4‑2)得到的混合液中,40‑75℃下,搅拌反应6‑16小时,反应结束后离心,离心得到的固体产物用去离子水洗涤,真空干燥,得到该比率型荧光探针。9.根据权利要求8所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,利用该比率型荧光探针进行核酸扩增产物检测的方法为:Ⅰ、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;Ⅱ、将步骤Ⅰ得到的探针溶液加入到待测样品进行核酸扩增反应后的产物中,搅拌均匀得到检测混合液,静置3‑20min;Ⅲ、利用波长为385nm的激发光源照射步骤Ⅱ得到的检测混合液,测量检测混合液在582nm处的黄色荧光强度I582以及554nm处的绿色荧光强度I554,计算出I582/I554的值,最后根据预先建立的表征荧光强度比值I1/I2与待测样品中目标物浓度关系的标准曲线fB,计算得到待测样品中的目标物浓度,实现核酸扩增产物的定量检测。10.根据权利要求9所述的用于核酸扩增产物检测的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,所述步骤Ⅲ中,标准曲线fB的构建方法为:a、将比率型荧光探针加入去离子水中,搅拌均匀,配制成探针溶液;b、根据要检测的目标物,预先一系列浓度的若干份体积均为V的目标物标准溶液,然后将每份目标物标准溶液于相同条件下分别进行核酸扩增;c、完成核酸扩增后,在得到的每份扩增产物中分别加入等体积、等浓度的探针溶液,搅拌均匀得到检测混合液,静置3‑20min;d、对于每一份检测混合液,测量其在385nm的激发光下,582nm处的荧光强度I582以及554nm处的荧光强度I554,计算出I582/I554的值,以目标物标准溶液的浓度为X轴,I582/I554的值为Y轴,进行曲线拟合,得到表征荧光强度比值I582/I554与目标物浓度关系的标准曲线fB。